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精原细胞体外培养的研究进展
精原细胞包括未分化型精原细胞和分化型精原细胞.通过体外培养精原细胞,重现精子发生过程,在发育生物学、生命起源和生育控制等领域具有重要意义；通过精原干细胞的体外培养,利用其多能性,诱导其产生多种组织类型的细胞,将是再生医学研究领域的热点,本文拟就精原细胞体外培养的影响因素作一综述,旨在为精原细胞体外培养体系的建立提供借鉴.
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小鼠精原细胞体外分化为精子细胞的研究
目的 探讨在辅以外源生殖激素混合培养的小鼠睾丸细胞中,精原细胞向精子细胞的转化.方法 采用7～8 d龄小鼠睾丸组织,以组合酶消化法制备睾丸细胞,在含重组卵泡刺激素(r-FSH)和睾酮的培养基中进行体外培养;定期观察细胞的生长和形态变化;用分子生物学和流式细胞技术对生长各阶段细胞进行分析.结果 培养5 d即可观察到形态与大小类似于圆形精子细胞,7 d后可见带有鞭毛与变形的精子细胞;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示,培养前细胞的睾丸特异蛋白激酶(TESK1)与鱼精蛋白2(Prm2)mRNA表达阴性,培养9与17 d细胞TESK1与Prm2 mRNA表达均阳性;DNA倍体分析显示,培养5 d细胞有单倍体峰出现,并随培养天数增加而增加.结论 在体外混合培养的小鼠睾丸细胞中加入外源生殖激素可以使精原细胞转化为精子细胞.
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SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响
目的 探讨SET蛋白对精原细胞株GC-1 spg增殖和凋亡的影响.方法 使用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5％ CO2条件下培养GC-1 spg细胞,分对照组(转染无关序列腺病毒)和实验组[转染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)];GC-1 spg接种于96孔板或者6孔板,转染腺病毒48 h、72 h后收集细胞,免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检测SET蛋白在GC-1 spg细胞中的表达与定位;提取细胞总蛋白,Western Blot检测转染前后SET蛋白的表达;细胞计数试剂盒-8 (CCK8)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法检测细胞的数目和增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果 SET蛋白表达于GC-1 spg细胞的胞核和胞浆中,且胞浆分布多于胞核;转染SET干涉腺病毒后,干涉组GC-1 spg细胞中的SET蛋白相对表达量为(0.217±0.044)显著低于对照组的(0.629±0.170) (P＜0.05),同时GC-1 spg细胞的数目减少,增殖减慢,且细胞凋亡率显著增加[干涉组(21.663±1.287)％,对照组(8.813±0.671)％](P均＜0.01).结论 SET蛋白在精原细胞GC-1 spg胞核和胞浆中均有表达,且胞浆分布多于胞核;GC-1 spg细胞中SET蛋白表达降低,能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,提示SET蛋白可能参与调节精子发生的过程.
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硫酸镍对体外培养小鼠精原细胞的损伤作用
目的 初步探讨硫酸镍(NiSO4)对小鼠精原细胞的毒作用.方法 采用MTT、分光光度法和透射电子显微镜分别检测NiSO4,浓度为0、25、50、100、200、400和800μmol/L,染毒6、12、24和36 h对体外培养小鼠精原细胞的增殖、乳酸脱氢酶(LDH)活力及其超微结构的影响.结果 NiSO4显著抑制体外培养小鼠精原细胞的增殖,且存在剂量/时间依赖性(r=1,P＜0.01).50 μmol/L NiSO4染毒24和36 h,100、200、400和800 μmol/L NiSO4染毒6、12、24和36 h时,精原细胞悬液LDH活力显著低于对照组(P＜0.05),并呈剂量/时间依赖性(r=-1,P＜0.01).此外,NiSO4还可引起小鼠精原细胞超微结构改变,主要表现为细胞皱缩、胞内出现空泡,细胞膜和核膜破裂,细胞器模糊不清等现象,特别是NiSO4浓度在200μmol/L以上变化更明显.结论 NiSO4对体外培养的小鼠精原细胞具有明显毒作用.
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硫酸镍对体外小鼠精原细胞所致氧化应激水平的研究
目的 探讨硫酸镍对体外培养小鼠精原细胞的氧化损伤作用.方法 进行小鼠精原细胞的体外分离、纯化和培养,设置对照组和硫酸镍(NiSO_4)50、100、200、400、800 μmol/L 5个测定组,等容积染毒后分别培养6、12、24和36h;在各染毒终点收割细胞,超声处理细胞悬液,离心取上清液,采用酶标仪检测总抗氧化能力(T-AOC)、羟自由基(-OH˙)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的变化.结果 镍可引起精原细胞-OH˙含量升高,T-AOC、GSH-Px活性降低.相同染毒时间,NiSO_4各浓度组与对照组比较:染毒36 h后NiSO_450 μmol/L组开始出现-OH˙含量升高及T-AOC水平的下降;染毒各时间段,NiSO_4200、400和800μmol/L组T-AOC、-OH˙含量及其GSH-Px活力与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05).相同浓度各染毒时间组与0 h比较:NiSO_450 μmol/L染毒36 h,开始出现T-AOC、-OH˙含量的异常变化(P<0.05);NiSO_4100μmol/L组染毒24 h及其以上均出现GSH-Px、-OH˙和T-AOC的改变(P<0.05);NiSO_4200 μmol/L及其以上组,各时间组T-AOC、-OH˙、GSH-Px与0 h比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在本试验条件下,镍对小鼠精原细胞的损伤可能与其所致氧化应激效应增强有关.
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环境内分泌干扰物2-溴丙烷对蝾螈精原细胞毒性的研究
目的探讨2-溴丙烷对精原细胞的毒性;建立蝾螈精原细胞离体培养系统用于检测化学物的生殖毒性.方法运用蝾螈离体精原细胞培养及整体染毒实验,研究2-溴丙烷对精原细胞的形态学、死亡率和增殖率的影响.离体染毒浓度为0.01、0.1、1 mmol/L,以FSH为阳性对照,L-15培养液为空白对照.整体实验给蝾螈一次性腹腔注射,剂量为0、200、600、1 800 mg/kg.结果不论是离体培养实验还是整体实验,随着2-溴丙烷染毒浓度的增高,精原细胞的增殖率下降、死亡率上升(P＜0.05),且呈剂量反应关系.组织学结果显示,2-溴丙烷在影响蝾螈其他脏器之前,先损害睾丸的精原细胞.精原细胞出现核固缩、细胞坏死.结论精原细胞可能是2-溴丙烷的靶细胞,蝾螈离体精原细胞培养系统可作为测定或筛选外来化学物生殖毒性的一种辅助手段.
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TNT对小鼠活体精原细胞SCE频率的影响
近年来国内外学者对TNT致突变性进行了较为广泛的研究.本实验采用姊妹染色单体交换(SCE)检测方法,观察了TNT对小鼠活体精原细胞SCE频率的影响,从而为TNT致畸和致癌等远期效应的深入研究提供了一定的实验依据.1 材料与方法1.1 动物第四军医大学实验动物研究中心提供,20～25 g健康雄性昆明小鼠.1.2 试剂 TNT由某兵工厂提供,研成粉末与少量精制植物油混匀,配制不同剂量的植物油溶液或过饱和溶液,供小鼠灌胃染毒用;5-溴脱氧尿苷(BrdU),Sigma公司产品;767针剂型活性炭,上海活性炭厂产品;质量浓度为0.04%的秋水仙素;20 mg/ml环磷酰胺(CP)储备液;0.3 mol/L氯化钠(NaCl)溶液与0.03 mol/L柠檬酸钠(Na\-3C\-6H\-5O\-7)溶液的等量混合液(2×SSC);pH6.8的磷酸缓冲液及质量浓度为2.5%的Geimsa染液.
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男性生殖相关基因功能研究策略
男性不育是较为常见的病症,约4%的男性受到不育的困扰.男性原发性不育与男性生殖相关基因的缺陷有密切关系.近年来,国内外发表了大量文献展示了新发现的与男性生殖相关的基因.刘美玲等[1]在采用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选大鼠精原细胞与精母细胞差异表达基因过程中,发现了大鼠睾丸特异表达基因LM23基因.沙家豪所在的重点实验室运用人胚胎和成人睾丸cDNA探针与人睾丸dDNA微阵列杂交,通过差异杂交的克隆进行序列测定和分析,筛选
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小RNA在精子发生中的研究进展
近20年来人们在动物、植物及病毒等生物中发现了一系列小分子非编码RNA,包括miRNA[1]、piRNA[2]和siRNA[3].与其相关的Argonaut家族蛋白分为2个亚家族:Ago亚家族和Piwi亚家族.精子发生是指由精原细胞经初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞至成熟精子形成的过程.整个过程分为3个阶段:精原细胞的增殖、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态过程,这一复杂的过程受多种因素的调控.近年来,小RNA在精子发生中的作用越来越受到人们的重视,现将三种小分子非编码RNA在精子发生中调控作用的研究现状概述如下.
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生命演绎·八字探秘
生命之由,其源乃父母洛书之五六交合(精卵结合)[1-2].父母洛书对待(泛指出生到死亡阶段,这里特指性成熟之后到更年期阶段)之四方(精原细胞、卵原细胞)于其合十[3-4]阶段(泛指性成熟之后到更年期阶段,这里特指婚恋阶段)激发中宫生数五(卵子)与乾宫成数六(精子)行五六交合,五六交合为三十(受精卵),如此受精卵河图成数之六产生.
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小鼠精原细胞的分离和纯化
目的探讨小鼠精原细胞的分离纯化. 方法用组合酶消化法制备7～8d小鼠的生殖细胞悬液;用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞. 结果所获细胞悬液内活细胞、死细胞及细胞团的百分比分别为90.08%、9.92%及8.91%;平均每个睾丸可获得4.136×105个细胞;精原细胞主要分布于位于27%～35%间的Percoll梯度中,其超微结构与7～8d小鼠睾丸切片内精原细胞的超微结构一致,经纯化后其纯度达68.76%. 结论用组合酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的7～8d小鼠的精原细胞能满足体外培养的需要.
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硒对氧化偶氮甲烷所致结肠癌模型大鼠睾丸精原细胞P16蛋白表达的影响
目的观察硒对氧化偶氮甲烷(AOM)所致结肠癌大鼠睾丸精原细胞P16蛋白表达的影响.方法随机将20只3周龄断乳雄性SD大鼠分为:正常对照组、实验对照组、AOM致癌前喂食亚硒酸钠水组、AOM致癌后喂食亚硒酸钠水组.每周腹腔注射AOM 15 mg/kg,持续2周,造成大鼠结肠癌模型.用4 mg/L Na2SeO3水溶液分别在AOM致癌前、后开始进行干预,并持续至实验结果.各组均于34周后取两侧睾丸,用免疫组织化学方法,观察大鼠睾丸精原细胞内P16蛋白的表达,并进行图像分析.结果正常组大鼠的睾丸内未见精原细胞表达P16蛋白,而实验对照组、硒干预AOM致癌组(AOM致癌前、后喂食亚硒酸钠水)的精原细胞P16均呈阳性表达,阳性产物呈深棕色,定位于细胞核中,细胞质内仅有少量表达.实验对照组、AOM致癌前、后喂食亚硒酸钠水组阳性表达逐渐增强,组间具有显著性差异(P<0.05).结论硒可增强AOM所致结肠癌大鼠精原细胞P16蛋白的表达.
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大鼠Sertoli细胞与精原细胞的分离及共培养
目的 分离纯化14 d大鼠Sertoli细胞与精原细胞,用Sertoli细胞作为饲养层对大鼠精原细胞进行体外培养研究.方法 酶消化法制备大鼠睾丸组织单细胞悬液,采用牛血清白蛋白(BSA)不连续密度梯度沉降法分离Sertoli细胞和精原细胞.结果 经分离的Sertoli细胞与精原细胞的纯度分别达到92.73%和78.36%.Sertoli细胞与精原细胞共培养,可见精原细胞发生分裂增殖等行为.结论 在添加EGF、bFGF和GDNF等细胞因子的10%胎牛血清DMEM/F12培养基中,精原细胞能够存活一定时间;而Sertoli细胞表现为旺盛的生长状态,并可促进精原细胞的分裂与增殖.
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新生昆明小鼠睾丸支持细胞和精原细胞的共培养及支持细胞的作用
目的 分离、纯化、培养小鼠睾丸支持细胞,通过与精原细胞共培养,研究体外培养的支持细胞对精原细胞的影响.方法 用复合酶消化、密度梯度离心和差异贴壁法分离、纯化、培养新生小鼠睾丸支持细胞,以苏丹Ⅳ染色鉴定支持细胞;用丝裂霉素-C处理支持细胞后作为饲养层,与精原细胞共培养;以直接分离培养的精原细胞作对照.倒置相差显微镜观察,细胞培养第3天,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定精原细胞的增殖率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/磷脂酰肌醇(ANNEXIN-V-FITC/PI)染色;激光扫描共焦显微镜观察记录精原细胞的凋亡率,比较精原细胞克隆大小、存活时间、增殖率和凋亡率的不同. 结果 分离、纯化后经苏丹Ⅳ染色鉴定的小鼠支持细胞纯度可达95%以上,与支持细胞共培养的精原细胞的克隆大小、存活时间和细胞增殖率明显高于对照组,而凋亡鲻率则明显低于对照组.结论支持细胞可以促进精原细胞的增殖,抑制其凋亡.
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长白猪精原细胞的分离和纯化
目的分离和纯化猪的精原细胞,从而对与人类具有高同源性的猪的精子发生进行研究. 方法酶消化法制备2月龄未成熟长白猪睾丸组织的单细胞悬液,以2%～4%牛血清白蛋白(BSA)连续梯度作为分离介质,采用重力沉降法并结合细胞贴壁培养的方法分离精原细胞. 结果重力沉降法分离细胞后所获精原细胞纯度为91%,进一步经过贴壁培养纯化后,精原细胞纯度达到94.2%. 结论该方法方便、快捷,分离效果好,能满足在分子水平研究精原细胞的需要.
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小鼠精原细胞移植技术的改进
目的 对现有小鼠精原细胞移植技术进行改进,建立更具操作性,易于推广的新方法.方法 分离含绿色荧光蛋白(GFP)的rC57BL6/tg14 (act-EGFO-Osb Y01)小鼠精原细胞作为供体细胞,应用自制的显微注射器将其从睾丸的精子输出管处,以锥虫蓝作为指示剂直接注入野生型预处理C57BL6小鼠精细管内完成移植.应用荧光显微镜观察移植效果并进行组织学分析.结果 移植后受体小鼠睾丸出现绿色荧光信号,组织学检查发现精细管中荧光信号显著高于周围组织,移植的供体小鼠(GFP)的睾丸细胞在受体小鼠睾丸中形成克隆和形成精子,而预处理的野生型小鼠睾丸精细管未发现.结论 含GFP蛋白的rC57BL6/tg14小鼠精原细胞在受体小鼠体内移植成功,此改进方法在简化精原细胞移植技术的同时可保证移植质量.
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肠壁隐睾症继发精原细胞瘤1例
患者男性,35岁.2年前无意中发现右下腹有“鸡蛋”大小包块,无明显不适,近来发现肿块变大,伴乏力,偶有右侧腹部隐痛及黑便,体重下降4 kg.肠镜示(全结肠)距肛缘55 cm处有一5cm×8cm大小肿块,占肠腔2/3,黏膜呈磊石状;活检标本质地硬,易出血.镜下见黏膜慢性炎症,部分区域淋巴细胞增生明显,淋巴滤泡形成.追问病史14年前行“双侧隐睾切除术”.查体:下腹部两侧各见一个5 cm长陈旧性瘢痕.右下腹触及包块,5 cm ×8 cm大小.于全麻下行右半结肠癌根治,探查肝、胃、胆囊、脾、网膜、腹膜、腹主动脉周围、盆腔未见明显异常结节;肿瘤位于回盲部升结肠,10cm×10cm×8 cm大小,侵犯浆膜,末段回肠无扩张但粘连较重.
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"贝奥"雄性不育灭鼠剂现场试验报告
"贝奥"雄性不育灭鼠剂没有直接的杀鼠作用,其有效成分雄性不育剂为棉酚和雷公藤内酯,能明显抑制鼠精原细胞、精子细胞中的LDH-C4,使鼠类不能生成成熟的精子而不育,从而整体上降低鼠类数量,大限度地减少鼠害.我们选择2个占地面积相当,鼠密度相近的企业进行现场试验,一个企业投放"贝奥"灭鼠剂,另一个设为空白对照,以观察该药对鼠类的现场控制效果.经过10个月的现场观察认为,该药对鼠类整体数量有一定的降低作用,但下降的幅度不太理想.
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肿瘤抗原MAGE-A:潜在的肿瘤标志物
黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene,MAGE)家族是肿瘤相关抗原,包括60多个家族成员.基于组织特异性表达和基因结构的不同,M AGE家族被分成两个大的子家族,MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ.MAGE-Ⅰ包含MAGE-A,MAGE-B和MAGE-C亚家族,在多种癌组织中高表达,并且在肿瘤发生和生长方面起重要的作用[1].MAGE-Ⅱ包括MAGE-D亚家族,其在正常人体内普遍表达.MAGE-A肿瘤相关抗原在极少的正常组织巾表达,典型的包括精原细胞、胸腺、胚胎.
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PA法检测精索静脉曲张大鼠生精细胞的早期凋亡
目的:采用AnnexinⅤ-FITC和PI标记法(PA)法检测外科所致的精索静脉曲张(VC)大鼠生精细胞的早期凋亡.方法:以成年雄性SD大鼠复制左VC模型,应用流式细胞术(flow cvtometry, FCM) PA 法(AnnexinⅤ-FITC和PI 标记法)检测睾丸生精细胞的早期凋亡. 结果:实验组大鼠睾丸生精细胞的凋亡率显著高于假手术对照组(P＜0.01),且左右侧睾丸凋亡率相同,1 n与4 n 细胞群凋亡率显著高于2n细胞群.结论:PA法可检测VC大鼠生精细胞的早期凋亡,并可较准确分析各期生精细胞凋亡.
