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警惕药源性不孕不育
据统计,约有4％ ～6％的不孕是由药物引起的.据临床观察发现,可导致不孕不育的药物主要有以下几种:抗生素类药物抗生素类药物中多含有激素成分,可导致内分泌失调,尤其是对于男性来说,可导致睾丸细胞代谢下降及供养不足,使生精细胞中的精子浓度下降,引起精子减少,导致不育.大环内酯药物,如红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素等,会造成精子发育停顿和有丝分裂减少,使精子被杀伤或被杀死,存活的精子活动力也明显下降.氨基甙类药能阻断初期精母细胞的减数分裂,故对精子发生有负面影响.
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男性生殖相关基因功能研究策略
男性不育是较为常见的病症,约4%的男性受到不育的困扰.男性原发性不育与男性生殖相关基因的缺陷有密切关系.近年来,国内外发表了大量文献展示了新发现的与男性生殖相关的基因.刘美玲等[1]在采用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选大鼠精原细胞与精母细胞差异表达基因过程中,发现了大鼠睾丸特异表达基因LM23基因.沙家豪所在的重点实验室运用人胚胎和成人睾丸cDNA探针与人睾丸dDNA微阵列杂交,通过差异杂交的克隆进行序列测定和分析,筛选
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基于"异类相制"的雷公藤复方对小鼠精母细胞凋亡及凋亡蛋白表达的影响
目的:探讨雷公藤复方单体成分对小鼠精母细胞凋亡及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响.方法:建立体外培养小鼠精母细胞体系,实验分为空白组,雷公藤甲素3.5 mg·L-1组,雷公藤甲素3.5 mg·L-1+梓醇3 mg·L-1组,雷公藤甲素3.5 mg·L-1+三七总皂苷12 mg·L-1组,雷公藤甲素3.5 mg·L-1+草酸铵1.5 mg·L-1组,雷公藤甲素3.5 mg·L-1+青藤碱0.75 mg·L-1组.流式细胞仪测定药物作用24 h后精母细胞凋亡率,Western blot测定精母细胞Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白表达情况.结果:梓醇、三七总皂苷可减轻雷公藤甲素对小鼠精母细胞凋亡的诱导作用,与雷公藤甲素比较有明显差异(P＜0.05),草酸铵和青藤碱组与雷公藤甲素组相比无明显差异;雷公藤甲素促使Bax,Caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,与正常比较差异显著(P＜0.01),雷公藤甲素配伍梓醇、三七总皂苷后Bax,Caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调,与雷公藤甲素比较较有明显差异(P＜0.05).而配伍草酸铵及青藤碱则差异不明显.结论:雷公藤甲素可引起精母细胞凋亡,并通过Bax/Bcl-2,Caspase-3系统启动精母细胞凋亡.而雷公藤复方组成中其他药物组分可不同程度抑制雷公藤甲素引起的精母细胞凋亡,减轻其雄性生殖毒性.
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低剂量棉酚和甾体激素联合用药对精母细胞凋亡和支持细胞吞噬作用的影响
目的 探讨低剂量棉酚和甾体激素联合用药对睾丸精母细胞数量、凋亡和支持细胞吞噬作用的影响.方法 本实验采用大鼠喂服棉酚与甾体激素联合用药方式[棉酚12.5mg/(kg·d)+去氧孕烯125μg/(kg·d)+炔雌醇25μg/(kg·d)+十一酸睾丸酮100mg/(kg·d)],与单独喂服相同剂量的棉酚或激素的大鼠及喂服载体溶剂的大鼠相对照,用药4、6和8周取睾丸组织,应用体视学、原位缺口末端标记(TUNEL)和油红O染色的方法 ,观察精母细胞和球形精子细胞数量、凋亡和支持细胞吞噬作用. 结果 联合用药中,甾体激素成分可明显减少精母细胞和球形精子细胞的数量,精母细胞凋亡增加并同时伴有生精上皮油红O染色的增强. 结论 精母细胞凋亡并被支持细胞吞噬是联合用药抗生育机制之一.
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stathmin的筛选及其对小鼠睾丸精原细胞的作用研究
目的:筛选并鉴定小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)自增殖相关的蛋白因子,并深入探讨其对SSCs自增殖及分化的影响.方法:通过建立有效的动物模型,运用双向电泳、质谱分析等蛋白组学的方法,筛选并鉴定与小鼠SSCs自增殖可能相关的蛋白因子;克隆所筛选蛋白的基因,使其与绿色荧光蛋白的基因融合,构建载体pEGFP-stathmin.转染体外培养的小鼠精原细胞及睾丸支持细胞,使其在该细胞中过表达.分别培养1、3和5 d后,以MTT法对细胞进行计数;通过原位杂交,对所筛选蛋白的基因在精原细胞中的表达进行分析.结果:成功筛选了4种与SSCs自增殖可能相关的蛋白,stathmin即是其中一种.在转染融合基因后培养的第2、4、6 天时,stathmin转染组精原细胞数显著高于空载体转染组以及正常对照组(P<0.05);原位杂交结果显示,stathmin主要表达在精原细胞中,而在精母细胞中有弱表达.结论:stathmin对小鼠精原细胞增殖具有促进作用,该影响极有可能作用于精原细胞向精母细胞的分化阶段.
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小鼠精母细胞钙通道特性及硝苯地平的作用
目的为了建立一个合理、客观评价药物或毒物对生殖系统影响的细胞模型,研究了机械分离、未经酶消化的小鼠精母细胞Ca2+通道特性及硝苯地平对其的作用.方法采用全细胞膜片钳技术.结果阻断K+电流后,当钳制电位-90 mV、指令电压-80～+10 mV、步阶电压10 mV时,记录到Ca2+电流,二价无机阳离子对Ca2+电流的抑制作用Ni2+>Cd2+,而L型Ca2+通道激动剂Bay K8644对电流无任何影响.分析小鼠精母细胞上记录的Ca2+电流为T型Ca2+通道开放产生.L型Ca2+通道阻断剂硝苯地平对精母细胞Ca2+电流有明显的抑制作用,半数大抑制浓度为0.39 μmol*L-1,而且细胞外液冲洗恢复缓慢,这支持了二氢吡啶类药物可用于男性避孕.结论机械分离、未经酶消化的小鼠精母细胞模型适合进行药理学和毒理学研究.
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睾丸组织异体异位移植生成成熟精子的动物模型建立
目的:采用免疫缺陷小鼠作为孵化器,建立小鼠睾丸组织异体异位移植生成精子的实验模型.方法:以新生小鼠睾丸组织为供体,免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植;采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)对移植物中睾丸特异蛋白激酶(testis-specific protein kinase 1,TESK1)mRNA表达进行检测,并应用组织形态学分析法对生精细胞的发育作进一步的验证.结果:分子生物学及组织学观察显示,移植物组织不仅可像正常小鼠睾丸组织一样表达TESK1 mRNA,并且富含与正常成年小鼠睾丸组织中类似的精曲小管结构以及各级生精细胞和精子.结论:移植后的生精细胞可在异体异位继续发育生长,完成整个生精过程,终发育精曲小管及成熟精子.
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睾丸高表达蛋白质HSD-14对小鼠精子发生的影响
目的 研究睾丸高表达基因HSD-14及其编码蛋白质对小鼠精子发生的影响.方法 利用本实验室构建的人睾丸特异ESTs文库,通过电子克隆方法获得一新基因命名为HSD-14基因.纯化原核表达的HSD-14蛋白,并制备兔多克隆抗体.通过HE染色观察腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后小鼠睾丸组织的生精变化,并进行TUNEL凋亡检测.结果 电子克隆获得HSD-14基因,在原核表达系统中表达成功.小鼠腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后,均发现曲细精管中生精细胞大量脱落,生精细胞的层次紊乱,管腔内有时可见成团脱落的生精细胞,附睾中几乎观察不到成熟精子.TUNEL凋亡检测结果表明,抗体注射组小鼠曲细精管中生精细胞(以精母细胞为主)凋亡程度较正常小鼠睾丸和免疫前血清注射组明显,且多数细胞停留在精母细胞甚至精原细胞的阶段.结论 HSD-14通过诱导精母细胞凋亡抑制小鼠精子发生.
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精原干细胞移植及其相关研究进展
睾丸功能有赖于精原干细胞持续不断的增殖,这些细胞紧贴于曲细精管基膜,埋嵌在支持细胞间,经过同源性扩增形成分化型精原细胞链,分化形成的精母细胞经过两次减数分裂形成精子细胞,后者经过变态过程后形成成熟的精子.在整个精子发生过程中,精原干细胞在所有生殖细胞类型中展现出巨大的细胞群扩增能力.另外,DNA在复制和减数分裂的过程中,很可能会出现DNA缺失,精原干细胞池作为携带遗传物质的始发点,对于基因组完整性的改变有重要意义.由此可见,精原干细胞为生殖细胞基因工程研究提供了一条路径.作为干细胞家族成员,精原干细胞具有永生化和多能化潜能,是精子形成的前体细胞,其终生扩增为男性精子细胞源源不断产生所必需,近年来对其研究越来越深入[1].随着对其研究过程中在方法学上的突破,尤其精原干细胞移植,使精原干细胞展现出广阔的应用前景.
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SET蛋白对精母细胞株(GC-2spd)增殖和组蛋白乙酰化的影响
目的:观察SET蛋白对GC-2 spd精母细胞株增殖和组蛋白乙酰化的影响,探讨SET蛋白调节精子形成的作用.方法:体外培养GC-2 spd细胞,通过精母细胞标志物乳酸脱氢酶C(LDHC)和睾丸特异激酶1(TESK1)鉴定.琼脂糖珠免疫共沉淀试剂盒检测SET蛋白与组蛋白H4的结合.分别转染空载腺病毒(AdH1-siRNA/NS,对照组)和SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET,干涉组),比较细胞增殖情况,荧光显微镜观察GC-2spd细胞中SET蛋白的表达;用实时定量逆转录聚合酶链反应(Red time RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测mRNA以及蛋白的表达.结果:免疫荧光显示精母细胞株GC-2 spd阳性表达LDHC和TESK1;SET蛋白表达于GC-2细胞的胞核和胞质中,免疫共沉淀提示SET蛋白与组蛋白H4结合.转染SET干涉腺病毒后,核内和胞质中SET蛋白表达明显降低(P＜0.01).与对照组相比,干涉组细胞增殖明显降低,组蛋白H4乙酰化水平明显增高(P＜0.05);但组蛋白乙酰化酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:精母细胞核内和胞浆中均表达SET蛋白;SET蛋白降调,则抑制GC-2spd细胞增殖.SET蛋白可能通过与组蛋白H4相互作用调节其乙酰化,参与调节精子形成.
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绞股蓝对小鼠精母细胞分化的影响
为研究绞股蓝对小鼠睾丸精母细胞分化的影响,取出3只健康6日龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠的睾丸进行体外培养,分别暴露于含终浓度为0(溶剂对照)、0.2、2、20 μmol/L绞股蓝溶液的培养液培养3d,并设阳性对照[200 μg/L卵泡刺激素(FSH)].经Spo11免疫染色,检测精母细胞的分化情况.结果发现,与溶剂对照组比较,各浓度绞股蓝染毒组小鼠睾丸精母细胞的Spo11阳性细胞率较高,差异均有统计学意义(P＜0.01);且随着绞股蓝染毒浓度的升高,小鼠睾丸精母细胞的Spo11阳性细胞率呈上升趋势.表明绞股蓝可在小鼠精子发生过程中促进精母细胞的分化.
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甘草对体外培养小鼠精母细胞分化的影响
为研究甘草对小鼠精子发生过程中精母细胞分化的影响,将健康6日龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠的睾丸组织分别暴露于终浓度为0(溶剂对照)、0.2、2、20 μmol/L的甘草溶液培养3d,并设阳性对照(卵泡刺激素,FSH),检测Spoi1蛋白质的表达.结果发现,与溶剂对照组比较,各浓度甘草染毒组小鼠精母细胞的分化率均增高,差异均有统计学意义(P＜0.01);且随着甘草染毒浓度的升高,小鼠精母细胞的分化率呈上升趋势.表明甘草能促进在小鼠精子发生过程中精母细胞的分化.
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甘草抽出物在体外实验中促进精母细胞的分化
目的:明确甘草对精子发生过程中精母细胞分化的影响.方法:采用小鼠睾丸器官培养方式,添加甘草抽出液,进行抗-Rec 8-抗体免疫染色,检测精母细胞的Rec 8的表达,判断其对精母细胞的分化的影响,同时设对照组.结果:发现甘草组和对照组相比有明显的促进精母细胞的分化,且显示浓度依赖性.结论:甘草能促进在小鼠精子发生过程中精母细胞的分化.
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GGNBP2与GGN在小鼠睾丸生精细胞定位及作用
目的 探讨配子生成素结合蛋白2(GGNBP2)和配子生成素(GGN)在小鼠睾丸生殖过程中的细胞定位以及作用,初步阐明GGNBP2缺失引起睾丸生精功能障碍的机制.方法 采用免疫沉淀方法检测GGNBP2与GGN相互作用;免疫荧光、免疫组化检测GGNBP2与GGN细胞定位;PCR检测野生型Ggnbp2基因敲除型小鼠睾丸生殖细胞GGN mRNA表达;Western blot检测其GGN蛋白表达.结果 GGNBP2与GGN相互作用,两种蛋白共同定位于精母细胞和精子细胞(Golgi phase,Cap phase)中的细胞核和胞浆,精子细胞(Acrosome phase,Maturation phases)中的顶体和尾部,GGNBP2缺失引起GGN mRNA水平和蛋白水平减低,在精母细胞中GGN定位改变.结论 Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷可能通过降低GGN表达,改变GGN细胞定位,DNA双链损伤修复机制受损.
关键词： 配子生成素结合蛋白2 配子生成素 精母细胞 精子发生 -
胀亡初级精母细胞的形态观察及测量
目的研究患者精液中胀亡初级精母细胞的各种形态及变化规律.方法采用瑞-姬氏染色,于光镜油镜下对生精细胞及胀亡生精细胞进行观察、摄像及测量.结果1.初级精母细胞与胀亡初级精母细胞(无核胀出型)胞体直径与胞核直径的比值明显缩小;2.胀亡初级精母细胞可表现出一系列的形态学变化:(1)细胞核肿胀明显,几乎占满整个胞体;(2)细胞核肿胀伴细胞核染色质溶解;(3)细胞核膨胀,使胞核胀出于胞体外;(4)由于胞核膨胀,使胞膜上胀出泡状物;(5)部分胀亡细胞核不膨胀,但胞质内含大量空泡,使胞体胀大;(6)细胞核肿胀、溶解,并出现细胞膜破坏、崩解.结论应用光学显微镜在瑞-姬氏染色下检查胀亡生精细胞,其细胞结构清晰、可靠,该方法简单、实用,并完全可以用于临床患者的检验和研究,是理想的检测胀亡生精细胞的方法.
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探讨青少年克氏综合症生育力保存的可行性
在无精症患者中克氏综合症是常见的染色体异常，而睾丸活检取精成功率随年龄增加或睾酮治疗后而下降。因此，在青少年克氏综合症患者青春期刚启动或睾酮治疗前是否能够增加睾丸活检取精成功率？作者回顾性分析8例15~17岁的克氏综合症患者（47, XXY），其中有一例为嵌合体47, XXY/46, XY。这些患者首先进行精液分析，如果为无精子，则至少间隔3个月复查1~2次精液分析，如果仍为无精子则考虑双侧睾丸活检及睾丸组织冷冻保存，并且在睾丸活检之前心理学医师将与患者确认进行生育力保存。结果只有1例嵌合体在精液中发现少量精子并进行4次精液冷冻保存，另外7例均为无精子，其中有5例同意进行睾丸活检，2例拒绝。在5例进行睾丸开放活检患者中，有1例发现有精子，另有1例发现有长形精子细胞和Ⅰ型精母细胞，均进行冷冻保存。后作者认为在青少年克氏综合症患者的精液或睾丸组织中也是可以获得精子的。并且睾丸组织中可能含有精原细胞、不完全分化的生精细胞和精子细胞。然而在进行睾丸活检前可能需要花费几个月的时间与患者及其父母进行沟通。此外，考虑在青春期刚启动后进行生育力保存的原因一方面是因为可以获取精液进行检查，另一方面患者已成熟可以考虑生育力保存以便孕育后代或面对睾丸活检失败的现实。
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自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用
目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.
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小鼠粗线期精母细胞钙离子通道膜片箝方法的建立
应用机械分离获得小鼠单个精母细胞,采用全细胞膜片箝技术记录Ca2+离子通道电流.结果表明:①阻断K+电流后,当钳制电位-90 mV、指令电压-60～+10 mV、步阶电压10 mV时,可记录到内向电流;②内向电流在-30～-40 mV达到大值;③在细胞外液中加入4 μmol/L TTX,对记录电流无影响,表明此电流不含有Na+电流成分,为Ca2+电流.
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Uchl1及其关联蛋白参与小鼠实验性隐睾中精母细胞凋亡
以往研究显示Uchl1参与调节生理状况下小鼠精母细胞的凋亡.本文以小鼠实验性单侧隐睾为研究模型,以切除单侧睾丸和假手术作为对照,用苏木精-伊红(HE)染色和DNA末端标记(TUNEL)观察生精细胞的形态和凋亡情况;用免疫组化分析Uchl1及其相关蛋白Jab1和p27kiP1在隐睾症的热应激反应导致精母细胞损失过程中的变化情况,并用亲和分析(pull-down)和免疫荧光共定位检测三种蛋白在精母细胞的关联性.结果显示,Jab1和p27kip1,与Uch1平行,在具凋亡形态的精母细胞中响应热应激而含量增加,而在多核巨细胞中无类似变化.Jab1可以与睾丸蛋白提取物中Uchl1结合,并与Uchl1和p27kip1特异性地在具凋亡形态的精母细胞中共定位.以上结果提示,Uchl1蛋白的积累参与隐睾中热应激诱导的生精细胞凋亡过程,但不影响接下来的多核巨细胞的形成,且Uchl1蛋白的作用机制涉及Jab1和p27kip1参与的一种新途径.
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甘草对小鼠体外精原细胞分化的影响
目的：观察甘草对小鼠体外精原细胞分化的影响。方法取3只小鼠的新鲜睾丸切成组织块后随机分为5组，对照组不予处理，低浓度组、中浓度组、高浓度组分别加入终浓度为0．2、2．0、20．0μmol／mL的甘草溶液，卵泡刺激素组加入等量卵泡刺激素培养液，培养3d。采用免疫组化法观察并计数精母细胞，计算精原细胞分化率。结果对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组和卵泡刺激素组精母细胞数分别为（1．98±0．51）、（67．23±8．73）、（82．57±9．27）、（117．42±10．93）、（109．93±11．13）个，精原细胞分化率分别为0．38％±0．06％、12．93％±1．67％、15．87％±2．53％、22．37％±4．37％、20．97％±5．13％；与对照组比较，其他各组精母细胞数及精原细胞分化率均升高，P均＜0．01；低浓度组、中浓度组和高浓度组两两比较，P均＜0．01；高浓度组与卵泡刺激素组比较， P均＞0．05。结论甘草能促进小鼠体外精原细胞分化为精母细胞，并呈一定浓度依赖性。
