首页 > 文献资料
-
蛋白酶体REGγ对雄性小鼠生精功能的影响
目的 研究蛋白酶体REGγ对雄性小鼠生精功能的影响. 方法 利用免疫蛋白印迹检测小鼠睾丸中REGγ的表达;通过组合酶消化法分离精原干细胞,流式细胞仪检测精原干细胞中c-kit及α6-integrin的表达;通过小鼠精子分析仪检测REGγ基因敲除雄鼠的精子浓度和精子活力;进行小鼠合笼实验检测正常雌鼠和REGγ基因敲除雄鼠合笼后的生育力.结果 REGγ在小鼠睾丸中高表达;应用组合酶消化法得到了纯度70％的精原干细胞;REGγ基因敲除雄鼠精原干细胞的c-kit及α6-integrin表达量均显著低于野生型组(P＜0.05);REGγ基因敲除型雄鼠的平均精子浓度(37.1×106/ml)和精子活力(54％)均显著低于野生型雄鼠(75.4×106/ml、74％) (P＜0.05);REGy基因敲除型雄鼠与野生型雌鼠合笼后的产仔数均低于野生型雄鼠(P＜0.05). 结论 蛋白酶体REGγ参与调节雄鼠的生精功能.
-
以支持细胞为饲养层培养冻存后大鼠精原干细胞研究
目的:研究冻存的精原干细胞体外分离培养的生物学特性,为今后冻存精原干细胞的批量培养和长期利用提供依据.方法:取7～8d的SD雄性大鼠,分离睾丸组织,用两步酶消化法和差速时间贴壁法,分离精原干细胞和支持细胞.以二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护液,将分离到的精原干细胞放置于液氮中冻存;利用体外培养体系,进行支持细胞的培养和饲养层的制备;然后将复苏的精原干细胞接种到支持细胞饲养层上培养,并利用碱性磷酸酶鉴定精原干细胞.结果:用两步酶消化法和差速贴壁法能分离到纯度较高的精原干细胞和支持细胞,冻存的SSCs解冻后能在支持细胞饲养层上贴壁、生长、增殖,碱性磷酸酶活性鉴定呈阳性.结论:冻存后精原干细胞在体外支持细胞饲养层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞提供细胞模型.
-
人类男性生殖组织库的发展趋势及伦理问题
以生殖力保存和预防疾病为目的,建立大型冷冻贮存库,分类冻存男性生殖细胞和组织,包括:精子、睾丸组织以及精原干细胞,并开展相关技术的研究,包括睾丸组织冷冻及原位和异位自体移植、精原干细胞的分离培养与低温保存、精原干细胞生精小管内移植,从而发展成为较为完善的男性生殖细胞/组织库,可能成为人类辅助生殖技术的一个发展趋势.
-
恒河猴精原干细胞的筛选、培养与鉴定
目的:建立恒河猴精原干细胞的筛选和培养方法.方法:采用改良的二步酶消化法分离恒河猴睾丸细胞,用改进的差异贴壁筛选法纯化恒河猴精原干细胞,用添加了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、可溶性GFRα1和bFGF的DMEM/F12无血清培养基和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养恒河猴精原干细胞,并通过形态观察、标志基因的免疫细胞化学分析和半定量RT-PCR分析鉴定培养细胞的干细胞活性.结果:分离纯化的恒河猴精原干细胞在添加了3种生长因子的培养基中能形成较大的干细胞克隆,并表达精原干细胞的标志基因.结论:本研究初步建立了恒河猴精原干细胞的培养体系,为进一步开展相关研究奠定基础.
-
食蟹猴精原干细胞分离纯化及鉴定
目的 掌握食蟹猴精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)体外培养生长特性,建立食蟹猴精原干细胞分离、纯化、培养及初步鉴定的方法.方法 经手术获取2岁14天食蟹雄猴单侧睾丸,采用三步酶消化法分离获得单细胞悬液和差异贴壁法富集精原干细胞.将细胞培养于经丝裂酶素C处理的STO细胞层上,使用添加神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、GDNF家族受体α(GFRa1)三种重要生长因子的无血清培养液体外培养,20d后采用CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR对培养的食蟹猴细胞进行SSCs初步鉴定.结果 通过差异贴壁法分离纯化富集的SSCs,接种到丝裂霉素C处理的STO饲养层细胞上,第2天开始分裂增殖.用含有生长因子的培养基培养2d细胞形成小集落,5d后细胞集落明显.培养20 d后,SSCs呈葡萄串状细胞簇,符合SSCs的形态特征,这些细胞经CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR均呈阳性表达.结论 本研究成功建立食蟹猴精原干细胞的分离纯化及鉴定体系.基于STO饲养细胞的添加GDNF、bFGF和GFRa1三种生长因子的无血清培养体系可用于食蟹猴精原干细胞培养,CDH1可作为食蟹猴精原干细胞鉴定的标志物.
-
基于PI3K/Akt通路观察五子衍宗方对老龄大鼠精原干细胞增殖的影响
目的:探讨五子衍宗方(Wuzi Yanzong Fang,WYF)基于磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路对老龄大鼠精原干细胞增殖的作用及其机制研究.方法:以自然衰老大鼠为研究对象,将40只18月龄SPF级SD雄性大鼠随机分为老龄模型组,WYF低、中、高剂量组,每组10只,另以10只2月龄大鼠作为青年组.WYF低、中、高剂量组分别灌胃给药0.4,0.8,1.6 g·kg-1,青年组、老龄模型组分别灌胃给予生理盐水,每周停药2d,持续给药4个月.末次给药后麻醉处死大鼠,快速取出睾丸组织.免疫荧光法检测Sertoli细胞数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),前髓细胞锌指蛋白(PLZF),干细胞因子(SCF)和骨形态蛋白4(BMP4) mRNA表达水平,免疫荧光法检测精原干细胞数量及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)和免疫荧光法检测磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(p-Akt)的表达与定位.结果:与青年组比较,老龄模型组Sertoli细胞数量未见明显差异,而GDNF,PLZF,SCF和BMP4 mRNA表达水平显著降低,精原干细胞数量减少,PCNA表达下降,PI3K,p-Akt蛋白表达降低(P＜0.01);与老龄模型组比较,WYF各剂量组GDNF,PLZF,SCF和BMP4 mRNA表达水平显著升高,精原干细胞数量增多,PCNA表达上调,PI3K,p-Akt表达明显增多(P＜0.05,P＜0.01).结论:WYF能够明显促进老龄大鼠精原干细胞的增殖,其作用机制可能与调节睾丸内P13K/Akt信号通路有关.
-
PP60C-SRC/ERK1/2信号通路调节大鼠精原干细胞活性
目的 研究PP60C-SRC通过磷酸化的细胞外调节激酶1/2(P-ERK1/2)调节体外培养的9日龄大鼠精原干细胞的活性.方法 用MTY观察反义C-SRC脱氧寡核苷酸(ODNs)及PD98059对精原干细胞活性的影响;用Western blot检测PP60G-SRC和P-ERK1/2的表达.结果 与空白对照组相比,10 μmol/L反义C-SRC ODNs作用12 h后精原干细胞活性下降了8.1%(P＜0.05),10 μmol/L PD98059作用24 h后精原干细胞活性下降了9.4%(P＜0.01).反义C-SRC ODNs组PP60C-SRC、P-ERK1/2蛋白表达与空白对照组相比分别下降了33.8%和45.3%(均P＜0.01);10 μmol/L PD98059作用精原干细胞24 h后,p-ERK1/2蛋白表达下降了34.5%.结论 PP60C-SRC可能通过P-ERK1/2蛋白而调节精原干细胞的活性.
关键词： 精原干细胞 PP60C-SRC 细胞外调节激酶1/2 大鼠 -
精原干细胞体外转化和转分化的研究进展
精原干细胞(sSc)在睾丸曲细精管内微环境的精确调控下,只能单向分化为精子.然而,SSC可在特定条件下转化为多能干细胞,甚至直接重编程转分化为功能性终末分化细胞.该特殊潜能使其在再生和精准医学领域具有很好的运用前景.
-
以GDNF为核心的哺乳动物精原干细胞调控网络
睾丸中的胶质细胞源神经营养因子由支持细胞、管周细胞、精母细胞和球形精子合成和分泌,是调节精原干细胞自我更新和分化的关键因子;GDNF通过与SSCs膜上受体GFRα1结合形成GDNF-GFRα1复合物,再结合并活化RET,后激活MAPK、SFK和PI3K-AKT信号通路并达到调控SSCs自我更新和分化的目的.
关键词： 胶质细胞源神经营养因子(GDNF) 精原干细胞 自我更新 哺乳动物 -
生殖细胞核因子在精原干细胞体外培养分化中的表达
目的 将分离纯化的小鼠精原干细胞(SSCs)体外培养并诱导分化,检测生殖细胞核因子(GCNF)在小鼠SSCs诱导分化前后的表达.方法 用干细胞因子(SCF)诱导小鼠SSCs向精母细胞分化,通过间接免疫荧光染色和RT-PCR,检测GCNF在小鼠SSCs诱导分化前后的表达.结果 小鼠SSCs向精母细胞诱导分化前后,在倒置相差显微镜下进行形态学观察,细胞形态未发生明显变化,仍然呈圆形或椭圆形,核较大;间接免疫荧光及RT-PCR结果均显示,原代培养的小鼠SSCs呈现GCNF阴性,但是向精母细胞诱导分化2d后,GCNF开始表达.结论 GCNF在体外培养小鼠SSCs向精母细胞分化的早期有表达,提示GCNF可能参与了SSCs的早期分化.
-
小鼠精原干细胞冷冻保存
目的 探索小鼠精原干细胞(SSCs)冷冻保存方法 以及解冻后体外快速增殖的条件. 方法 实验以6d龄雄性昆明小白鼠为材料,两步酶消化法分离小鼠睾丸生殖细胞,Percoll非连续密度梯度离心法富集小鼠精原干细胞,随后加入不同的冷冻液以及采用不同的降温速率冷冻小鼠精原干细胞.以MEMα为基本培养基,加入10%胎牛血清和100μg/L的胶质细胞源性神经营养因子, WST-8比色法分析培养SSCs 复苏后的增殖率,运用碱性磷酸酶细胞化学染色和RT-PCR技术,对培养的SSCs进行鉴定. 结果 冷冻液中添加10%二甲基亚砜、10%胎牛血清、0.07mol/L蔗糖时,以1℃/min程控降温方式冷冻小鼠SSCs,细胞解冻后活率高,达84%以上;采用非程控降温方式冻存SSCs,尽管细胞解冻后活率相对于程控降温方式略低,但具有方法 简单、易于操作、无需昂贵仪器的优点,复苏后SSCs贴壁时间为8～12h,24h可见细胞分裂,48h细胞出现迅速增殖,96h可见较多含20～25细胞的细胞团,此时精原干细胞增殖近5倍. 结论 本实验所用培养条件,可以使经长期冷冻的SSCs短期快速增殖.
-
Bmil基因在小鼠睾丸组织中的表达定位
精原干细胞能通过自增殖不断地自我更新,形成不同发育阶段的生精细胞并维持其正常数目.Broil基因属于Polvcomb家族,近发现它对造血干细胞、白血病干细胞、神经干细胞等自增殖有调控作用.我们用自制的BMI1多克隆抗体,通过免疫荧光技术定位该基因在小鼠睾丸组织中的表达,并用FISH做进一步验证,为进一步揭示精原干细胞自增殖的分子机制奠定基础.
-
精原干细胞增殖和分化阶段小鼠睾丸基因的差异表达
目的 分析精原干细胞增殖和分化阶段小鼠睾丸组织基因表达谱的变化,初步探讨精原干细胞增殖和分化的调控机制. 方法 48只雄性昆明白小鼠采用间隔24 d二次腹腔注射白消安(10 mg/kg)制备小鼠精子再生模型,8只作为对照组.根据精子再生过程生精上皮的组织形态学变化以及精原细胞增殖情况选取精原干细胞处于增殖和分化阶段的睾丸组织,运用基因表达谱芯片检测2个阶段的睾丸组织基因表达差异,对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 检测到睾丸组织差异表达基因911个.上调608个(增殖期/分化期)、下调303个.差异表达基因分别涉及生物学过程、分子功能和分子组成.84个信号通路功能改变差异有统计学意义(P<0.05),包括Notch和wnt信号通路.与干细胞相关的差异基因有56个,上调40个、下调16个.部分干细胞的阳性标记物(如CA9、Stra8、hgb1、Oct4和Thy1)和部分生长因子(如Fgf2、Csf1和Pdgfa)上调. 结论 小鼠精原干细胞增殖和分化过程的调控涉及许多基因(分属不同信号通路)的差异表达,这些基因和通路对精原干细胞增殖的作用还有待进一步研究.
-
胶质细胞源性神经营养因子对精原干细胞促进作用机制的研究
目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)促进精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)增殖作用的分子机制.方法 2012年1-12月合成针对GDNF基因的多个干扰性小RNA(small interfering RNA,siRNA),以慢病毒为载体构建GDNF的慢病毒质粒,转染由日龄5～7 d SPF级健康雄性昆明小鼠睾丸组织分离出的SSCs,筛选出GDNF基因干扰效率高的SSCs作为实验组,以GDNF基因未干扰的SSCs作为对照组.酶联免疫法分别测定两组SSCs转染后第1～4天的吸光度A值,以比较两组的增殖率.流式细胞仪检测两组SSCs的凋亡率.逆转录PCR法检测两组SSCs中GDNF、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)、Fyn和局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的mRNA表达.结果 实验组转染第1～4天的吸光度A值分别为0.45 ±0.02、0.68 ±0.03、1.12±0.03、2.24±0.04,对照组分别为0.46±0.03、0.73±0.02、1.32±0.05、1.15±0.06,第3、4天两组数据比较差异有统计学意义(P＜0.05).实验组和对照组SSCs凋亡率分别为(25.43±1.91)％和(5.61±0.16)％,差异有统计学意义(P＜0.05).实验组和对照组SSCs中GDNF、RTKs、Fyn、FAK的mRNA表达率分别为(12.32±1.22)％和(54.25±1.34)％、(16.24±1.35)％和(45.35±1.37)％、(18.32±1.34)％和(38.37±1.55)％、(20.04±1.65)％和(43.27±1.28)％,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 GDNF通过上调RTKs、Fyn和FAK的表达对SSCs的增殖起促进作用.
关键词： 精原干细胞 胶质细胞源性神经营养因子 分子机制 -
非灵长类动物精原干细胞及其多潜能性的研究进展
精原干细胞(SSC)既具有自我更新能力又能分化成精子,是雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给子代的成体干细胞.新研究发现,SSC在体外特殊培养条件下能够去分化形成胚胎样多潜能干细胞,进而转分化生成3个胚层来源的细胞.上述研究主要是在非灵长类动物体内进行的.本文主要针对非灵长类动物SSC的生物学特性、分离纯化、培养、鉴定、移植等进行简要的概述,并对其多潜能性及可塑性的研究进展进行讨论,旨在探讨SSC在男性不育症治疗和人类再生医学领域的应用潜能.
-
精原干细胞标志物的研究进展
精原干细胞是精子生成的源泉,因此它在非梗阻性无精症患者的治疗、生物工程学、遗传及转基因研究等方面有广阔的应用前景.目前,众多学者采用多种方法进行筛选,得到一些用于鉴定它的相对特异的标志物,如α6和β1整合素、c-kit、胶质细胞源神经营养因子的受体、Piwi基因等,但仍没有获得一个单一的特异性高的筛选指标.现对精原干细胞的细胞生物学特性、细胞表面分子、细胞内特异分子三方面标志物的研究成果予以总结.
-
精原干细胞移植受体鼠模型的建立
目的 通过对4周龄昆明白小鼠腹腔内单次注射白消安来制作精原干细胞移植受体鼠模型.方法 将实验动物分为4组,A、B、C组注射白消安的剂量分别是3 0 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg体重,D组为对照组.注射后每天记录小鼠的存活情况,注射白消安后的20 d、30 d、40 d称量睾丸重量、测定血常规、制作并观察睾丸组织学切片、统计曲细精管的中空率.结果 A、B、C、D组的死亡率分别是25.00%、31. 58%、80.00%、0.00%,注射白消安后30 d各组小鼠曲细精管中空率分别是45.25%、75.2 5%、1.50%、0.00%,白细胞、红细胞、血小板数量等血常规指标均恢复正常.结论 腹腔内单次注射30 mg/kg或40 mg/kg剂量的白消安,死亡率较低(25 .00%、31.58%),30 d后曲细精管中空率较高(45.25%、75.25%)、血常规指标恢复正常 ,适合做精原干细胞移植受体.
-
非人灵长类动物精原干细胞研究进展
精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是维持精子发生的一类干细胞,由于与人亲缘关系的相近性,使得开展非人灵长类动物SSCs研究具有重要的理论意义和比较医学价值.本文综述了非人灵长类动物SSCs的生物学特性、鉴定方法、冷冻保存、移植及生精细胞缺失模型建立等方面的研究进展.
-
精原干细胞移植及其相关研究进展
睾丸功能有赖于精原干细胞持续不断的增殖,这些细胞紧贴于曲细精管基膜,埋嵌在支持细胞间,经过同源性扩增形成分化型精原细胞链,分化形成的精母细胞经过两次减数分裂形成精子细胞,后者经过变态过程后形成成熟的精子.在整个精子发生过程中,精原干细胞在所有生殖细胞类型中展现出巨大的细胞群扩增能力.另外,DNA在复制和减数分裂的过程中,很可能会出现DNA缺失,精原干细胞池作为携带遗传物质的始发点,对于基因组完整性的改变有重要意义.由此可见,精原干细胞为生殖细胞基因工程研究提供了一条路径.作为干细胞家族成员,精原干细胞具有永生化和多能化潜能,是精子形成的前体细胞,其终生扩增为男性精子细胞源源不断产生所必需,近年来对其研究越来越深入[1].随着对其研究过程中在方法学上的突破,尤其精原干细胞移植,使精原干细胞展现出广阔的应用前景.
-
精原干细胞移植的研究进展
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,包括胚胎干细胞和成体干细胞.精原干细胞(SSC)是一种成体干细胞,是哺乳动物成体睾丸生精上皮中唯一可复制的多能二倍体细胞,能在体外分离纯化、培养、冻存,可进行同体或异体移植.1994年Brinster和Zimmermann首次进行SSC移植试验,有关SSC的研究越来越多,SSC成为生殖领域巾的研究热点.主要以小鼠为例,就SSC的生物学特征、增殖与分化和移植及其相关研究进行综述.
