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不同冷冻方法对人睾丸精子冷冻保存效果的研究
目的 比较不同冷冻保护剂和不同冷冻载体对人睾丸精子的冷冻保存效果. 方法 选取在兰州大学第一医院生殖医学专科医院进行诊断性睾丸穿刺获得成熟活动精子的患者,以及行睾丸精子ICSI术后的患者,在知情同意下将剩余睾丸组织冷冻保存,共46例.将每例睾丸组织分为4份,随机分成4组进行冷冻:1.8 ml冷冻管+甘油复合冷冻剂(A组,46例);1.8 ml冷冻管+Fasrun冷冻保护剂(B组,46例);0.25 ml麦管+Fasrun冷冻保护剂(C组,46例);超微量冷冻麦管+ Fasrun冷冻保护剂(D组,46例).冷冻标本经液氮熏蒸后投入液氮,比较各组复苏后精子活力和复苏率. 结果 冷冻前各组的活动睾丸精子能够满足ICSI操作所用精子量;冷冻复苏后,C组和D组能够容易找到正常活动精子(≥0.1/200倍视野)的例数显著高于A组、B组(P＜0.05);D组解冻后运动精子复苏率显著高于A组、B组(P＜0.05),C组解冻后运动精子复苏率显著高于A组(P＜0.05). 结论 应用改良的超微量冷冻麦管+ Fasrun冷冻保护剂能够提高睾丸精子的冷冻复苏率.
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维生素E和B12对冷冻精子活力和DNA的保护作用
目的 探讨维生素E(Vit E)和Vit B12对冷冻精子活力和DNA的保护作用.方法 收集在我院生殖医学中心就诊的32例正常男性精液标本,按照添加维生素的不同分为3组:对照组:精液中只添加常规冷冻保护剂;Vit E组:添加常规冷冻保护剂和5 mM的VitE;Vit B12组:添加常规冷冻保护剂和0.5％的Vit B12.比较3组精子复苏后的精子活动力、存活率、顶体酶活性、精子DNA碎片率(SDF)等指标.结果 经液氮冷冻72 h复苏后,Vit E组活动力(a+b)级的精子数、精子存活率均显著高于对照组(P＜0.01);顶体酶活性在各组间比较无显著性差异(P＞0.05);Vit E组和Vit B12组的SDF[分别为(12.16±0.50)％、(13.02±0.48)％]均显著低于对照组的(15.18±0.78)％(P＜0.01);Vit E组的精子DNA平均晕轮直径[(6.76±0.14)μm]显著高于对照组[(6.09±0.18)μm](P＜0.01),Vit B12组与对照组比较无显著性差异(P＞0.05).结论 精子冷冻保护剂中添加适当浓度的Vit E可以缓解冻融过程对精子造成的伤害,在一定程度上提高冻融后精子活动力、存活率及精子DNA完整性.
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小鼠精原干细胞冷冻保存
目的 探索小鼠精原干细胞(SSCs)冷冻保存方法 以及解冻后体外快速增殖的条件. 方法 实验以6d龄雄性昆明小白鼠为材料,两步酶消化法分离小鼠睾丸生殖细胞,Percoll非连续密度梯度离心法富集小鼠精原干细胞,随后加入不同的冷冻液以及采用不同的降温速率冷冻小鼠精原干细胞.以MEMα为基本培养基,加入10%胎牛血清和100μg/L的胶质细胞源性神经营养因子, WST-8比色法分析培养SSCs 复苏后的增殖率,运用碱性磷酸酶细胞化学染色和RT-PCR技术,对培养的SSCs进行鉴定. 结果 冷冻液中添加10%二甲基亚砜、10%胎牛血清、0.07mol/L蔗糖时,以1℃/min程控降温方式冷冻小鼠SSCs,细胞解冻后活率高,达84%以上;采用非程控降温方式冻存SSCs,尽管细胞解冻后活率相对于程控降温方式略低,但具有方法 简单、易于操作、无需昂贵仪器的优点,复苏后SSCs贴壁时间为8～12h,24h可见细胞分裂,48h细胞出现迅速增殖,96h可见较多含20～25细胞的细胞团,此时精原干细胞增殖近5倍. 结论 本实验所用培养条件,可以使经长期冷冻的SSCs短期快速增殖.
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微流体装置线性去除猪MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂的实验研究
低温保存后的卵母细胞在使用前必须要去除冷冻保护剂,目前常用的分步法去除步骤繁琐,容易丢失细胞,而且会对细胞造成致命的渗透损伤.为减小细胞渗透损伤,设计制作适合卵母细胞保护剂去除的微流体装置,研究微流控线性法去除猪MⅡ期卵母细胞低温保护剂时在不同时间(6、8、10 min)下卵母细胞的体积变化,以及对卵母细胞存活率与发育率的影响;并与传统的去除方法(一步法和分步法)进行比较.结果表明,采用微流体装置线性去除冷冻保护剂,8 min为实验中的优去除时间;线性法能够明显减小细胞的渗透损伤,其大归一化渗透膨胀体积为1.12±0.07,卵母细胞的存活率、卵裂率及囊胚率分别达到83.6％、72.4％、21.5％,均显著高于一步法和分步法(P＜0.05).因此,微流控线性去除冷冻保护剂能够显著减小细胞的渗透损伤,为卵母细胞低温保存技术提供新思路.
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冷冻保存血小板的研究进展
冷冻保护剂和添加液的正确选择是保证冷冻血小板质量的重要因素.冷冻血小板体内即刻止血功能明显优于液体保存血小板.为更好地保证冷冻血小板的质量,了解二甲亚砜(DMSO)在冷冻血小板保存过程中的作用及其作用机理、DMSO冷冻血小板止血功能增强的机理及不同因素对冷冻保存血小板的影响具有重要意义.本文就冷冻血小板的长期保存及质量标准、DMSO引起冷冻血小板分子改变及抑制激活作用的机理、不同因素对冷冻血小板保存效果的影响、保存效果的检测、冷冻血小板在灾害救援和军事行动中的应用及犬冷冻血小板的研究进行综述.
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改良外周血造血干细胞冷冻保存剂的临床应用
自体外周血造血干细胞移植近年来在国内外得到广泛应用，已成为治疗恶性血液病和多种实体瘤的有效方法。造血干细胞冻存技术的应用，使患者有充裕的时间选择佳预处理方案进行造血干细胞移植，体外保存过程中有效地保证造血干细胞的活力是移植成功的关键，冻存干细胞的效率高低直接影响移植成功率。经典外周血造血干细胞深低温冷冻保护剂多使用10%二甲基亚砜和人血白蛋白，但存在一定风险[1]，我们改良了细胞冻存保护剂对13例患者进行32次自体外周血造血干细胞采集后冷冻保存，取得较好的临床效果，现总结如下。
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玻璃化冻存对兔关节软骨细胞存活率及代谢活性的影响
目的 探索理想的关节软骨细胞低温保存方法.方法 分别采用玻璃化冻存法、程序性降温法及梯度降温法对兔关节软骨细胞进行低温保存,通过流式细胞仪计数及阿尔新蓝染色等方法了解复苏后软骨细胞的存活率、凋亡率及生物活性.结果 采用玻璃化冻存法保存的软骨细胞存活率为(86.57±1.67)％,明显高于传统的程序性降温法及梯度降温法;玻璃化冻存对软骨细胞合成糖胺多糖的能力有一定影响,但与新鲜未冷冻组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冻存法较传统的保存方法能显著提高冷冻保存后兔关节软骨细胞的存活率,并能维持细胞的生物活性,是一种理想的软骨细胞低温保存方法.
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深低温冷冻保存气管的实验研究
二甲基亚砜或合用二甲基亚砜和蔗糖是目前常用的冷冻保护剂,也是常用于气管冻储的冷冻保护剂[1].海藻糖是近年来发现并开始应用的一种非穿透性冷冻保护剂.我们将二甲基亚砜和海藻糖合用作为气管的冷冻保护剂,探讨其是否优于其他冷冻保护剂.
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不同甘油浓度保护剂对冷冻精液复苏率的影响
目的 探讨精液冷冻保护剂中不同甘油浓度对冷冻精液复苏率的影响.方法 分别用三种不同浓度甘油的保护剂对23例合格供精者的精液进行冷冻后复苏率的检测.结果 10%甘油组冷冻复苏率为(64.4±4.1)%,8%甘油组冷冻复苏率为(69.7±4.6)%,与10%甘油组相比有显著差异(P＜0.05),6%甘油组冷冻复苏率为(77.8±5.1)%,与8%甘油相比差异显著(P＜0.05),与10%甘油组相比差异极显著(P＜0.01).结论 用6%甘油的冷冻保护剂对人类精液的冻存效果更佳.
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慢速程序化冷冻对家兔卵巢功能的影响
目的 观察PROH加S慢速程序化冷冻对家兔卵巢组织形态学、ER、PR、ki67蛋白和bcl-2蛋白表达的影响.判断复苏后卵巢组织抗原性、细胞增殖活性和抗凋亡指数是否发生改变,为今后卵巢组织移植和体外培养的研究奠定基础.方法 卵巢组织取自8只健康的日本大耳白家兔,采用慢速程序化冷冻,对新鲜和复苏后卵巢组织采用组织学和免疫组化学分析.结果 在新鲜和冻融的卵巢组织中卵泡的密度、分布和直径没有显著性差异;免疫组化结果显示:冻融后的家兔卵巢组织ER、PR、ki67蛋白和bcl-2蛋白表达与新鲜组比较无明显变化(P>0.05).结论 PROH加S慢速程序化冷冻对家兔卵巢组织形态学、抗原性、细胞增殖活性和抗凋亡指数无明显的影响.
关键词： 家兔卵巢组织冷冻保存 冷冻保护剂 组织学分析 免疫组化分析 -
程序降温羟乙基淀粉冷冻保存自体造血干细胞移植治疗恶性血液病
1.目的:6%羟乙基淀粉(HES)、4%白蛋白和5%二甲亚砜(DMSO)构成的保护剂的毒性较单纯的10%DMSO冷冻保护剂低,但前者用于造血干细胞非程序降温-80℃冰箱冷冻保存.该课题旨在将含羟乙基淀粉的低浓度DMSO冷冻保护剂用于程序降温冷冻保存,探讨冷冻保护剂对造血干细胞活性的影响,改进冷冻保护剂的临床应用.
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两种冷冻保护剂对人精子冷冻复苏后活动能力的影响
目的 探讨两种不同的精子冷冻保护剂TYB和HSPM对人精子复苏后前向运动百分率(a+b)%的影响.方法 25例禁欲2 ～7 d的健康男性精液同时采用两种冷冻保护剂进行冷冻,比较复苏后精子的前向运动百分率.结果 冷冻前精子的前向运动百分率平均为(58.4±6.2)%,TYB和HSPM冷冻保护后复苏精子的前向运动百分率平均分别为(45.2±5.2)%和(42.5±4.6)%,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TYB和HSPM对冷冻后复苏精子的前向运动无影响.
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胚胎发育期和冷冻保护剂剂量对Nakagata小鼠胚胎冷冻效果的影响
目的 利用不同剂量的冷冻保护剂,对ICR和Km小鼠不同发育期的胚胎进行冷冻和解冻实验.探讨N akagata小鼠胚胎玻璃化冷冻管方法,使用不同剂量的冷冻保护剂等因素对冷冻效果的影响 . 方法 2细胞期胚胎在KSOM微滴培养液内分别培养到2细胞、4细胞和8细胞期胚胎,分别加入50 μL,100 μL,200 μL的DAP213冷冻保护剂,利用Nakagata方法冷冻,解冻以及观测解冻后培养至囊胚期胚胎的冷冻效果.结果 冷冻保护剂DAP213剂量和ICR,KM小鼠胚胎不同细胞发育期对冷冻效果具有显著的交互影响(P＜ 0.01).相对而言,冷冻保护剂剂量对结果的影响(P＞0.05)低于胚胎细胞发育期对冷冻效果的影响(P＜0.01).结论 冷冻保护剂的剂量和胚胎细胞发育期均会影响冷冻实验的结果.胚胎的细胞发育期对冷冻效果的影响更大.对2细胞期,4 细胞期和8细胞期的胚胎进行冷冻.8细胞期胚胎的冷冻效果好,4细胞期胚胎冷冻效果差.利用Nakagata冷冻管方法建立小鼠胚胎冷冻库,100 μL冷冻保护剂效果较好.不同小鼠的品系也可影响冷冻结果.
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三种冷冻保护剂对新生小鼠睾丸组织冷冻效果的比较
目的 探讨三种不同冷冻保护剂对新生C57BL/6J小鼠睾丸冷冻的效果.方法 5日龄C57BL/6J雄鼠睾丸组织,分别用3种不同冷冻保护剂(二甲基亚砜＜ dimethyl sulfoxide,DMSO＞、丙二醇＜propylene Glycol,PROH＞、EFS20/40)进行玻璃化冷冻.复苏冷冻后的睾丸组织,每组一部分进行组织学分析,另一部分进行组织移植,移植后检测关键基因表达水平以及卵胞质内单精注射,并设相应对照组.结果 3个实验组睾丸组织形态改变与对照组相比均具有显著性差异(P＜0.01),其中EFS组分值低即改变小;原位移植8周后组织块生长发育,存活率分别为DMSO组16.7％、PROH组13.3％、EFS组23.3％,存在成熟精子;睾丸组织特异性基因pgk-2和TESK1正常表达;卵胞质内单精注射表明移植后睾丸内精子均具有受精能力,胚胎移植后可得到正常子代小鼠(DMSO:PROH:EFS=5:2:8).结论 3种冷冻保护剂均能良好保存睾丸组织结构和功能.其中,EFS方法保存的睾丸组织形态改变小、功能完善更适于睾丸组织的冷冻.
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两种冷冻保护剂和冷冻程序对兔精子冷冻效果的比较
目的 比较不同冷冻保护剂和冷冻程序对兔精子冷冻保护的影响,以期提高兔精子冷冻保存的效果和效率. 方法 用三步降温法(程序Ⅰ)和两步降温法(程序Ⅱ)两种冷冻程序与终浓度分别为2%,3%,4%,5%的甘油和乙酰胺两种冷冻保护剂配合进行精液冷冻保存,统计精子复苏率. 结果 使用程序Ⅱ添加3%乙酰胺的冷冻保护剂实验组的精子复苏率较高,同其它组比较差异有显著性意义(P<0.05);程序Ⅱ比程序Ⅰ节省约70%的时间,同种浓度冷冻保护剂的不同冷冻程序组之间精子复苏率差异无显著性意义(P>0.05). 结论 程序Ⅱ与3%乙酰胺配合可以取得良好的冷冻保存效果;用程序Ⅱ进行兔精液冷冻保存可以大幅缩短操作时间.
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不同载体用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻的初步研究
目的：比较不同载体用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻的效果。方法选择冰珠、自制叶片、冷冻环这三种载体，分别用于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻后移植，比较不同组合的复苏率、临床妊娠率、植入率。结果冰珠组的复苏率、妊娠率、植入率为明显低于自制叶片组和冷冻环组，差异具有统计学意义(P<0.05)；自制叶片组和冷冻环组的复苏率、妊娠率、植入率差异无统计学意义(P>0.05)。结论冷冻载体选择自制叶片和冷冻环均可以取得较满意的冷冻效果，其中自制叶片的成本更低，所以应用自制叶片于人卵裂期胚胎玻璃化冷冻效果好且更经济。
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卵巢组织玻璃化冷冻的研究进展
冷冻保存胚胎、卵母细胞或者卵巢组织是目前保存女性生殖内分泌功能的可选途径.相比之下,卵巢冷冻的优越性是卵母细胞或胚胎冷冻无可比拟的.传统的冷冻技术已经在临床推广应用,但由于操作过程复杂、医疗仪器昂贵、耗费时间长等,使其在一般的实验室无法推广应用.玻璃化冷冻操作简单、省时省力、且能减小传统慢冻所造成的冰晶组织损伤,注定其必将为人所关注并将渐渐被推广.但迄今为止,玻璃化冷冻尚未形成一个完整的标准体系.综合近几年玻璃化冷冻研究进展,展望其研究前景和目前存在的问题,努力思考如何建立卵巢组织的玻璃化冷冻.
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玻璃化冷冻技术的研究进展
玻璃化冷冻技术是一种快速冷冻细胞或组织的方法,随着辅助生殖技术的发展而受到广泛关注.该项技术具有冷冻速度快、冻融损伤小,操作简单等优点,能够提高冷冻复苏后的存活率和妊娠成功率.玻璃化冷冻技术在临床应用中主要受到冷冻保护剂的类型和浓度、冷冻温度、冷冻速度及冷冻承载工具等一系列因素的影响.由于冷冻对象的不同,所实施的具体方法也不尽相同.该技术目前尚未成熟,如何优化人卵母细胞、胚胎及卵巢组织的玻璃化冷冻方案仍需要进行深入的研究.
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玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展
玻璃化冷冻技术近年已广泛应用于生殖领域,尤其是在女性生育力的储备方面展示其特有的优势.目前胚胎玻璃化冷冻已较成熟,并应用于临床.首次卵母细胞玻璃化冷冻的成功以及实验动物卵巢组织成功移植并获得分娩给研究带来无限希望,但目前仍处于实验阶段,研究者企图从不同角度解决难题.卵母细胞冷冻后,细胞结构的易损伤性造成的低复苏率.以及对卵巢组织玻璃化冷冻的可行性探索,对生殖领域提出新挑战.由于卵巢组织冻存与卵母细胞的冻存有着密不可分的联系,就两者国内外新进展做综述.
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卵子冷冻在女性生育力保存中的作用研究进展
自1986年世界首例冷冻卵子冻融复苏后行体外受精一胚胎移植(IVF-ET)获得妊娠成功后,卵子冷冻在辅助生殖技术领域掀起热潮.卵子冷冻为女性的生育力保存开辟了新前景,但由于技术及条件的制约,卵子冷冻及其应用一直在摸索中发展.随着冻融技术、胞浆内单精子注射及未成熟卵体外培养技术的发展,卵子冷冻近年取得一定进展.已在临床应用,为女性生育力保存奠定了基础.但冻融后的卵子存活率、受精率、胚胎着床率及临床妊娠率仍明显低于常规体外受精-胚胎移植,有待进一步研究.就近年来卵子冷冻的进展及其应用综述.
