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海藻糖保护干扰素粉针制剂
海藻糖作为一类安全性很好的药用辅料,可用于干扰素制剂中作为蛋白保护剂使用,为生物制品的保护剂提供了更多的选择.
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海藻糖的特性分析及应用优势
海藻糖的理化性质海藻糖的性状:海藻糖为白色晶体,含两个水分子,易溶于水和热乙醇中,不溶于乙醚.很难被其他酶水解,只能被特异性的海藻糖酶水解.强酸水解时会得到2个分子的葡萄糖.海藻糖的甜度和甜质:海藻糖的甜度是砂糖的45％.甜味持久温和,可以与其他甜味剂调和复配,改善产品味道,无不良后味.
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海藻糖在焙烤食品中应用研究进展
海藻糖(Trehalose)是一种安全的天然糖类,是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖,从黑麦的麦角菌中首次提取出来.其广泛存在于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其他无脊椎动物中,在霉菌、蘑菇等真菌中含量高达干重的20%.海藻糖自身性质非常稳定,并对多种生物活性物质具有保护作用.在近年的食品添加研究中,因其独特的生物学特性,海藻糖成为研究和开发的热点.海藻糖以其优良的加工性能,已经被应用到食品及药品等行业,在日本近50%的海藻糖被应用到了焙烤食品中.
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海藻糖在饮料中的应用优势及研究进展
海藻糖是两个葡萄糖分子以α,α-1，1键连接成的非还原性双糖，初由Wiggers从黑麦的麦角菌中分离得到，后来在多种动植物和微生物中均发现了海藻糖的存在，如藻类、酵母、真菌、细菌、虾等。海藻糖是一种贮藏性碳水化合物，具有独特的生物分子及细胞保护功能，《Nature》杂志发表了海藻糖的专文之后，海藻糖便有了“生命之糖”的美誉。基于海藻糖的保湿性、低甜度、不致龋齿等特性，近年来海藻糖在食品、医药领域以及化妆品方面的应用愈加广泛，其生产技术和应用研究也颇受研究者的关注。
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海藻糖用于小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究
目的 探讨海藻糖对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响. 方法 采用12只小鼠控制性超排卵获得的360枚成熟的卵母细胞,分别放入含1.0、0.5、0.3及0 mol/L的海藻糖中孵育3h.部分卵母细胞进行碘化丙啶(PI)染色；320枚卵母细胞进行玻璃化冷冻和复苏,并进行体外受精,观察卵母细胞成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率. 结果 0.3 mol/L海藻糖组复苏率、受精率与对照组无显著差异(92.59％ vs.90.90％,70.67％ vs.61.43％),但是卵裂率、囊胚形成率均高于对照组(83.02％ vs.44.19％,72.72％ vs.47.37％)(P＜0.001)；0.5 mol/L海藻糖组复苏率、受精率、囊胚形成率与对照组无显著差异,但是卵裂率高于对照组(65.22％ vs.44.19％)(P＜0.05)；0.3 mol/L海藻糖组囊胚形成率高于0.5 mol/L海藻糖组(72.72％ vs.50.00％)(P＜0.001);1.0 mol/L海藻糖组卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率、囊胚形成率均低于对照组低(P＜0.001). 结论 一定浓度范围的海藻糖对小鼠卵母细胞的玻璃化冷冻有保护作用,0.3 mol/L海藻糖浓度比较适合小鼠卵母细胞玻璃化冷冻.
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海藻糖对冷冻后人类精子活力的影响
目的 比较添加不同浓度海藻糖的冷冻保护剂对人类精子复苏后活动力的影响. 方法 选取2014年3月-2014年12月山西省人类精子库35名捐精志愿者的精液标本,分别采用基础配方、三种不同浓度海藻糖的改良配方的冷冻保护剂进行冷冻,其中基础配方作为对照组、三种不同浓度海藻糖的改良配方作为实验组,比较两组精子复苏后的活动力和精子运动参数. 结果 四种冷冻保护剂复苏后精子前向运动精子比例(PR)均达到40％,复苏率均高于60％.实验组中50mM组和100mM组复苏后PR分别为49.8％与54.1％,明显高于对照组43.6％,精子复苏率明显高于对照组,差异有统计学意义.其中实验组100mM组PR和复苏率明显高于其他三组,复苏后PR均值达到54.1％,复苏率达到86.0％,三个实验组精子的运动参数均高于对照组,其中以100 mM组运动参数有优势. 结论 在精子冷冻保护液中添加适当浓度的海藻糖有利于精子活力的保存.
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卷柏StTPS基因克隆及其在复苏过程中的表达分析
卷柏为典型极端耐旱的复苏药用植物,海藻糖在植物复苏过程中发挥重要作用,海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)是植物体内合成海藻糖的关键酶.该研究根据卷柏转录组数据拼接获得海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列,以卷柏总RNA为模板合成cDNA,采用RT-PCR法克隆验证该序列,并进行生物信息学分析,结果显示该序列编码区长2 799 bp(St TPS,GenBank号MH155231),编码932个氨基酸,无信号肽,StTPS可能定位于叶绿体上且无跨膜结构,包含2个糖原磷酸化酶糖基转移酶(GPGTF)家族的保守结构域.在此基础上,模拟卷柏复苏(脱水和复水)过程,应用qRT-PCR进行其在复苏过程中的表达量分析,并同步采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定卷柏复苏过程中海藻糖含量变化.结果显示StTPS基因相对表达量及海藻糖含量均随着脱水时间的延长而增加,随着复水时间的延长而下降,且二者之间呈正相关,初步说明StTPS在卷柏复苏过程中发挥重要作用.
关键词： 卷柏 海藻糖 海藻糖-6-磷酸合成酶 qRT-PCR 基因表达 -
不同冷冻保护剂在羊卵巢整体冻存中的效果比较
目的 应用自制梯度浓度混合-程控降温器官灌注仪,灌注羊完整卵巢,并行程序化冷冻,探讨冻融羊完整卵巢的效果并筛选佳冷冻保护剂组合.方法 将收集的28个羊完整卵巢,随机分配到新鲜对照组(A组)、海藻糖组(B组)、甘油组(C组),二甲基亚砜(DMSO)组(D组).冻融后组织切片行HE染色及原位缺口末端转移酶标记技术(TUNEL)检测,并通过RT-PCR技术检测组织Bcl-2相关X蛋白(Bax)及冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的mRNA表达.结果 B组正常卵泡形态比率与A组差异无显著性(P＞0.05),C组及D组正常形态卵泡比率显著低于A组,差异有统计学意义(P＜0.05).B、C、D3组冻存组基质细胞密度均低于A组,其中D组低,差异具有统计学意义(P＜0.05).冻存组中,B组TUNEL反应阳性的细胞数目显著少于C组及D组,差异具有统计学意义(P＜0.05),且均显著多于新鲜组.A组及B组bax基因mRNA的表达量明显低于C组及D组(P＜0.05);B组CIRP基因mRNA的表达量明显高于C组及D组,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 羊卵巢整体冻存后可较好保存组织学形态,海藻糖组的冷冻保护剂在组织结构保存及抑制细胞凋亡方面优于甘油组及DMSO组.
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中华按蚊雌成蚊体内海藻糖及海藻糖酶含量变化的研究
目的 了解中华按蚊雌成蚊体内海藻糖及海藻糖酶含量的变化规律.方法 利用ELISA测定羽化不同时间的中华按蚊雌成蚊体内的海藻糖及海藻糖酶含量,利用单因素方差和Tukey多重比较方法进行统计学分析.结果 中华按蚊体内海藻糖及海藻糖酶含量随羽化时间的延长先增加后减少,成蚊产卵后,体内海藻糖及海藻糖酶含量低于吸血前.海藻糖含量在羽化第2天达大值〔(2.6585±0.1165)mg/g〕,不同羽化时间海藻糖含量差异有统计学意义(F=21.383,df=100,P<0.05);海藻糖酶在羽化第3天达大值〔(0.1116±0.0025)μmol/g〕.结论 中华按蚊雌成蚊体内海藻糖及海藻糖酶含量在羽化后均呈规律性变化,可能与蚊虫能量的积累和消耗有关.
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海藻糖和蛋黄在人类精子冻于保存中的保护作用
人类精子冻干保存中损伤除了来自环境溶液对精子生理活性的损伤外,还会来自于冷冻和干燥过程.目前精子冻干保存中保护剂选取基本上都从生理化学角度考虑,目的为抑制精子内酶活性,没有考虑对冷冻和干燥损伤的抑制.大量文献表明蛋黄能减小冷冻对精子的损伤,而二糖(特别是海藻糖)在细胞干燥中具有特殊保护作用.本研究在前人一般使用的精子冻干保护剂中加入海藻糖,或同时加入海藻糖和蛋黄,通过伊红Y染色、低渗膨胀和电镜显微观测实验,比较不同组成的保护剂对精子结构和膜的保护作用.结果 表明,通过加入海藻糖修正的保护剂能提高对精子结构的保护效果,当同时加入海藻糖和蛋黄时效果更好.
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海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展
冰冻干燥方法是保存血细胞佳的方法,因为冻干的血细胞制品能在常温下保存,性能稳定,保存时间长,便于运输,保存费用低廉等优势,解决了目前血细胞保存的局限性.然而,在冻干过程中血细胞膜的损伤、细胞功能的降低是一个重要的问题.目前,研究者多以海藻糖为保护剂,将海藻糖导入血细胞内,对血细胞进行冻干.本文主要综述冻干对血细胞损伤机理,海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状.
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不同冻干保护体系对海藻糖负载红细胞冻干保存影响的研究
本研究旨在评价冻干保护剂人血白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘油对海藻糖负载后红细胞冰冻干燥保存的影响,筛选佳冻干保护体系.将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol/L的海藻糖溶液中孵育7h,经PBS液冲洗3遍后制成海藻糖负载的浓缩红细胞.对照组为海藻糖负载红细胞不添加保护剂,直接冻干；实验组将人血白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等组成的冻干保护体系与海藻糖负载浓缩红细胞混合,两组样品在常温下平衡30 min,移入-80℃深低温冰箱,预冻24h,入冻干机冻干处理24h.用温度为37℃,6％羟乙基淀粉40注射液快速再水化样品,用氰化血红蛋白试剂盒测定血红蛋白溶血率,计算血红蛋白回收率,同时测定干燥样品含水量.结果表明:当样品含水量在3％-4％时,对照组冻干红细胞血红蛋白回收率为(33.57±2.89)％,白蛋白组血红蛋白回收率为(51.15±1.98)％,差异有显著性意义(P＜0.05).选用不同浓度的葡聚糖为冻千保护剂,血红蛋白回收率较对照组明显降低,随浓度增加,血红蛋白回收率逐渐升高,当浓度为36％时,血红蛋白回收率为(22.15±4.12)％,差异有显著性意义(P＜0.05).不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)组成的冻千保护体系,当浓度小于40％时,血红蛋白回收率明显低于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).10％甘油组血红蛋白回收率为(3.93±1.80)％,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:人血白蛋白在海藻糖负载的冻干红细胞中发挥重要保护作用,葡聚糖与浓度小于40％ PVP可削弱细胞内海藻糖的保护作用.液态的甘油不宜作为红细胞冰冻干燥保存的保护剂.
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人红细胞对糖类摄取的规律性研究
人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义.一些糖类,特别是海藻糖,能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性,但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战.本研究探讨人红细胞对糖类摄取的规律性.于不同温度(4、25和37℃)、不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L)及不同培育时间(1、3、5、7、9小时)条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量,并测定了红细胞变性指数.结果表明:随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加,红细胞的糖吸收率也随之上升,细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmnol/L和40 mmol/L以上.但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同,随着时间的延长,细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势,而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势.但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响,尤其是海藻糖,这主要来源于渗透压伤害.结论:红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切,而且在一定条件下的糖吸收效率也较高,但此过程对红细胞有一定的伤害,这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景.今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系.
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海藻糖抑制高浓度葡萄糖诱导的红细胞磷脂酰丝氨酸暴露、渗透脆性增高和膜脂质过氧化损伤的研究
尽管高浓度葡萄糖孵育有利于深低温或冰冻干燥保存人红细胞的存活,但是高浓度葡萄糖仍然对红细胞造成一定损伤.本研究探讨海藻糖对高浓度葡萄糖导致的红细胞损伤的影响.将红细胞于合有一定浓度海藻糖的葡萄糖缓冲液中孵育3小时后,用流式细胞术分析红细胞磷脂酰丝氨酸(PS)分布和细胞渗透脆性,用TBA法检测膜脂质过氧化损伤.结果表明:葡萄糖可以导致红细胞PS暴露、脂质过氧化损伤和细胞渗透脆性增高,而且其效率和葡萄糖浓度和温度密切相关.然而,海藻糖却可以很好地抑制高浓度葡萄糖诱导的红细胞PS暴露、渗透脆性增高和过氧化损伤.随着海藻糖浓度的增加,红细胞PS标记率、丙二醛(MDA)浓度和细胞碎片率呈逐步下降的趋势.结论:高浓度葡萄糖可以导致细胞PS暴露、脂质过氧化损伤和渗透脆性增高,而且这3种损伤之间存在一定关系;海藻糖可以有效地抑制高浓度葡萄糖导致的红细胞PS暴露、渗透脆性增高以及过氧化损伤,这对于应用小分子糖类保存红细胞研究具有重要意义.
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人红细胞冻干前负载海藻糖佳化研究
为更好的实现海藻糖在红细胞冻干保存中的保护作用,关键是克服质膜对海藻糖的非渗透性,使胞质内海藻糖达到有效浓度.本研究的目的是通过对人红细胞负载海藻糖的规律性研究,筛选出海藻糖负载的佳负载条件并评价海藻糖负载对红细胞各项理化指标的影响.在不同孵育温度(4、22和37℃)、孵育时间(0、2、4、6、8、10小时)、不同负载缓冲液浓度(0、200、400、600、800、1 000 mmol/L)条件下检测新鲜红细胞对海藻糖的成功负载量及红细胞各项理化指标;在固定负载条件下,对新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖负载、游离血红蛋白(FHb)、血红蛋白(Hb)和红细胞平均体积(MCV)进行了比较.结果表明:红细胞对海藻糖的负载与孵育温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关.随着温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加,红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加.在海藻糖负载佳条件下,新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞的胞内海藻糖浓度、FHb浓度分别为65.505±6.314 mmol/L、66.2±5.002 mmol/L和6.567±2.568 g/L、16.168±3.922 g/L.结论:红细胞负载海藻糖的佳条件是采用新鲜红细胞,在37℃条件下、海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时,这一条件可使胞内海藻糖达到有效浓度,并保持红细胞细胞理化性质稳定和膜完整性.
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人红细胞冻干后复水条件的初步研究
本研究旨在探讨不同复水条件时冻干红细胞回收率的影响,为冻干红细胞复水条件的优化提供实验依据.在一系列不同条件下,包括复水溶液、复水温度、复水阶段红细胞胞体积变化速率(即蒸汽预复水)等,对冻干红细胞进行复水,检测红细胞复水后回收率并检测冻干红细胞复水后各项理化功能的改变.结果显示:在复水液配方中以PBS为基液配制的10%(w/v)PVP40溶液效果较好.在复水温度方面,低于37℃时红细胞回收率随着温度的升高而增加,42℃比37℃略差,37℃下复水效果好.在加入复水液之前将样品放置在37℃的饱和蒸汽环境中预复水能提高红细胞回收率并使细胞体积和体积分布宽度更接近于新鲜细胞数值.复水后红细胞理化性质的检测显示,红细胞的变形性较常规保存的红细胞有所下降,但胞内ATP酶、G-6-PD酶、SOD和2,3-DPG的活性降低较少,酶活性回收率大于红细胞回收卒.结论:人红细胞冻干后佳的复水条件是:冻干红细胞在37℃的饱和蒸汽环境中预复水,复水液为PBS+10%PVP40,复水温度为37℃,但对冻干复水过程中的细胞膜的保护还需进行更深入的研究.
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冷冻干燥保存血小板的实验研究
本研究探讨冷冻干燥保存血小板的方法,以获得可长期冻干保存的血小板制品,使之能在常温条件下保存、占用空间小、重量轻、便于长距离运输,能够满足突发事件和战伤救治的需要.在冷冻干燥保存过程中添加血小板可逆性激活抑制剂、DMSO和海藻糖等低温保护剂,进行预处理、冷冻、一级干燥、二级干燥,再水化,并同时测定血小板回收率,凝血酶聚集反应,促凝血功能,CD62p表达率和PAC-1表达率等.结果表明:血小板回收率为56.29%,其对凝血酶的聚集反应与对照组无明显差异,对ADP和丙基没食子酸诱导的聚集反应较对照组分别降低49.34%和26.25%.促凝血功能与对照组比较也无统计学差异;冻干血小板CD62p表达率为42.36%,PAC-1表达率为2.12%,凝血酶激活后CD62p再表达率为50.88%,PAC-1再表达率为54.55%.结论:添加血小板可逆性激活抑制剂,海藻糖和DMSO后的冻干血小板,其聚集活性和促凝血功能与新鲜血小板无明显差异,血小板可逆性激活抑制剂降低了冻干血小板的CD62p表达,增强了冻干血小板的生存能力,因而延长了其生存时间,因此可以该冻干方法为基础进一步提高冻干保存血小板的效率.
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改良血小板添加液低温液态保存血小板的形态及功能研究
本研究探讨使用改良的血小板添加液替代70%自体血浆在低温(10℃)液态条件下对血小板的保存效果.采集6名供者单采血小板,每一名供者单采血小板平均分为3组,A组(常规保存组)加入100%血浆、22℃保存;B组(添加液10℃保存组)加入70%PAS-ⅢM/30%血浆、10℃保存;C组(冰冻保存组)加入100%血浆和海藻糖、-85℃保存;另设D组(血浆4℃保存组)加入100%血浆、4℃保存,作为扫描电子显微镜对照组.A、B组在第1、5、7、9天取样,C组在20天后复苏取样,分别检测CD62p、HSR、PAgT、LDH的变化.血浆常温组、添加液低温组于保存后第3、9天取样扫描电镜观察,血浆低温组于保存后第3天取样观察,冰冻组在20天后复苏取样观察,同时使用新鲜血小板作为对照.结果表明,保存期内随保存时间延长,A组和B组CD62p表达增加,HSR和大聚集率降低;A组的LDH释放、CD62p表达、HSR、血小板大聚集率与B组比较有显著统计学差异(p＜0.05).C组LDH释放明显较其他两组增多,但CD62p表达较少(p＜0.05).A、B组血小板形态保持较好,C组血小板形态保持差.结论:改良的PAS-ⅢM保存液能够替代血浆用于血小板的保存,在低温条件下能够很好地保护血小板的功能,保存效果优于血浆常温保存.
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人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究
为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法,筛选出佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化,绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线,筛选合适的负载条件,分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂,用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性,用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率,加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度.结果表明:海藻糖负载效率与孵育时间(2小时后)、温度(30-40℃)呈良好线性关系,在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60%,载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度(＜50mmol/L)的升高而递增;同负载前相比较,血小板平均体积(MPV)、血小板对4种激活诱导剂的大聚集率均无显著性差别(P＞0.01),经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高,但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降.结论:37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L为合适负载条件,添加可逆性血小板激活抑制剂后,冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响.
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冻干血小板再水化后聚集
本研究旨在观察冻干血小板再水化后聚集反应性变化.以4种不同浓度的凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原作诱导剂,使用APACT2型血小板聚集仪,检测冻干再水化和新鲜血小板的大聚集率,以ADP为诱导剂,检测胞内外海藻糖对再水化冻干血小板大聚集率的影响.结果表明:当凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1 U/ml、1.6 mg/ml、20 μmol/L、2 μg/ml时,新鲜血小板大聚集率达100%左右,冻干再水化血小板大聚集率分别达(70.17±7.36)%、(15.3±2.81)%、(68.67±6.86)%、(64.67±11.6)%.胞内外海藻糖组、胞外海藻糖组、空白对照组冻干再水化血小板大聚集率分别达(66.0±4.69)%、(25.3±2.42)%、(11.5±1.87)%(P＜0.01).结论:凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1 U/ml、1.6 mg/ml、20 μmol/L、2 μg/ml可作为血小板聚集实验的合适浓度,胞内外海藻糖使冻干再水化血小板大聚集率显著提高.
