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血小板冻干再水化的形态结构与凋亡
目的 探讨冷冻干燥法对血小板的细胞形态、超微结构和细胞凋亡的影响.方法 以新鲜血小板为对照,以保存30 d后再水化的冻干血小板为实验对象,分别在倒置相差显微镜和透射电镜下观察血小板的细胞形态和超微结构,用流式细胞仪(FCM)检测血小板凋亡率,并以1×103U/L凝血酶为诱导剂检测再水化血小板的聚集活性.结果 与新鲜血小板相比,冻干再水化后的血小板在形态上为圆盘状,未见有明显的细胞聚集,仅细胞透光性相对较弱;超微结构上也无明显变化,其内部基本结构清晰可辨,细胞膜、细胞器及分泌颗粒的包膜保持完整.新鲜血小板的细胞早期凋亡率为(0.44±0.19)%,显著低于冻干血小板的细胞凋亡率(3.25±1.68)%(P<0.05).冻干再水化血小板的大聚集率为(93.28±2.3)%.结论 冻干再水化的血小板形态结构完整,细胞内超微结构完好,为本实验室成功建立血小板冻干保存方法提供了依据.
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人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究
为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法,筛选出佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化,绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线,筛选合适的负载条件,分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂,用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性,用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率,加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度.结果表明:海藻糖负载效率与孵育时间(2小时后)、温度(30-40℃)呈良好线性关系,在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60%,载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度(＜50mmol/L)的升高而递增;同负载前相比较,血小板平均体积(MPV)、血小板对4种激活诱导剂的大聚集率均无显著性差别(P＞0.01),经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高,但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降.结论:37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L为合适负载条件,添加可逆性血小板激活抑制剂后,冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响.
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冻干血小板再水化后聚集
本研究旨在观察冻干血小板再水化后聚集反应性变化.以4种不同浓度的凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原作诱导剂,使用APACT2型血小板聚集仪,检测冻干再水化和新鲜血小板的大聚集率,以ADP为诱导剂,检测胞内外海藻糖对再水化冻干血小板大聚集率的影响.结果表明:当凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1 U/ml、1.6 mg/ml、20 μmol/L、2 μg/ml时,新鲜血小板大聚集率达100%左右,冻干再水化血小板大聚集率分别达(70.17±7.36)%、(15.3±2.81)%、(68.67±6.86)%、(64.67±11.6)%.胞内外海藻糖组、胞外海藻糖组、空白对照组冻干再水化血小板大聚集率分别达(66.0±4.69)%、(25.3±2.42)%、(11.5±1.87)%(P＜0.01).结论:凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1 U/ml、1.6 mg/ml、20 μmol/L、2 μg/ml可作为血小板聚集实验的合适浓度,胞内外海藻糖使冻干再水化血小板大聚集率显著提高.
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冻干血小板再水化后稳定性的实验研究
目的 探讨冻干血小板再水化后的稳定性变化.方法 使用血细胞计数仪测定冻干血小板再水化后细胞计数回收率,以及在室温条件下随放置时间的不同,胞内外海藻糖浓度变化的趋势.结果 冻干血小板再水化后,细胞计数回收率在8 h内保持稳定.胞外海藻糖浓度为30 mM和1%人血清白蛋白混合物,可使冻干血小板回收率显著提高(P＜0.01).结论 负载海藻糖的冻干血小板再水化后8 h内仍保持较好的稳定性,海藻糖可使冻干再水化血小板的稳定性显著提高.
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不同冷冻温度、时间对冻干血小板回收率和残留水的影响
目的：探讨不同冷冻温度、时间对冻干血小板回收率及残留水的影响。方法依据温度、时间不同的冻干流程分3组（A组、B组和C组），分别进行血小板冻干、复水试验。用干燥称重的方法检测冻干血小板残留水含量，比较不同冷冻温度、时间对冻干血小板回收率和残留水的差异，同时比较不同冷冻温度、时间冻干血小板复水后MPV、PDW的差异。结果不同冷冻温度、时间条件下，冻干前与冻干复水后血小板MPV结果的差异均无统计学意义（P>0.05）；冻干前与复水后血小板PDW结果比较，A组和C组的差异均无统计学意义（P>0.05），而B组冻干复水后血小板PDW高于冻干前血小板PDW，且差异有统计学意义（P<0.05）；A组、B组和C组冻干血小板复水回收率分别为（81.72±12.43）%、（81.40±8.79）%和（94.37±7.02）%，3组冻干血小板复水回收率的差异均无统计学意义（P>0.05）；A组、B组和C组冻干血小板残留水分别为（6.55±0.96）%、（7.10±1.20）%和（5.18±0.89）%，3组冻干血小板残留水含量的差异均无统计学意义（P>0.05）。结论3组不同冻干温度、时间冻干血小板残留水、复水回收率相比，选择C组血小板冻干流程为后续研究血小板冻干程序，为血小板冻干流程的建立奠定基础。
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冻干血小板保护液优化的实验研究
目的 优化冻干血小板保护液,减少冻干过程对血小板的损害,有效保护其功能.方法 采用3因素3水平的正交设计法,对血小板膜保护剂、血小板激活抑制剂、蛋白质类保护剂的3类成分组成的保护液进行优选.检测血小板大聚集率、血小板活化标志PAC-1、CD62P的阳性表达率和血小板回收率,通过比较其差异,筛选出本实验的优冻干血小板保护液.以优化保护液对血小板处理后进行冻干,并以此为实验组,与新鲜血小板和原保护液处理后冻干血小板进行比较验证,验证指标与优选指标相同,比较3者4项指标之间的差异.结果 正交设计试验结果显示:血小板大聚集率组间高(74.33±24.01)％,血小板活化标志PAC-1和CD62P低于9组平均水平,血小板回收率高于9组平均水平.以主要体现血小板功能的血小板大聚集率为优先指标,结合其余3项检测指标进行综合分析,在原保护液的基础上,筛选出添加了2％ DMSO、第2信使调节剂、2 mmol/L维生素B6,75％的PPP保护液组为优组合.验证实验结果显示,优化保护液组血小板大聚集率(76.12±6.02)％,与原保护液组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),与新鲜血小板组相比,差异没有统计学意义(P＞0.05).优保护液组血小板激活标志PAC-1和CD62P阳性表达率分别为(3.23±0.49)％和(36.83±8.21)％,2者与原保护液组、新鲜血小板组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);优保护液组冻干血小板复水化后血小板回收率为(85.90±2.24)％,与原保护液组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本实验优化的血小板保护液优于原保护液,明显提高了冻干血小板复水化后大聚集率,能更好地保护血小板的功能,但对血小板冻干过程的保存损害问题没有得到更好的改善,有待下一步深入研究.
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羧甲基壳聚糖-血小板复合材料在兔耳动脉出血模型中止血作用的实验研究
目的 探讨可溶性羧甲基壳聚糖-浓缩血小板复合止血材料在新西兰白兔耳动脉出血模型的止血效果.方法 将32只新西兰白兔随机分为4组:可溶性羧甲基壳聚糖/血小板复合止血材料组(CC/PRP)、羧甲基壳聚糖组(CC)、冻干血小板组(FDP)及空白对照组(BC),8只/组,建立耳动脉出血模型,并将对应的止血材料敷于新西兰白兔耳部出血创面,观察各组材料的止血时间和出血量.结果 对于建立的耳动脉出血模型,各组材料均可完成止血.CC/PRP组、CC组及FDP组的止血时间和出血量均明显少于BC组,差异有统计学意义(P＜0.05);而CC组与FDP组间止血时间及失血量差异显著(P＜0.05);与单独使用CC或FDP相比,CC/PRP组止血时间显著性缩短,出血量明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 羧甲基壳聚糖和PRP联合使用对新西兰白兔耳动脉出血具有更加显著的止血效果.
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冻干血小板用于动物创面治疗的初步安全性评价
目的 对冻干血小板FDP用于动物创面愈合的治疗做初步安全性评价.方法 FDP单次皮肤刺激试验选择10只SD大鼠,采用自身对照,背部左侧皮肤为实验组:用棉签涂抹0.6 mL复水化FDP;右侧为空白对照组:涂抹0.6 mL生理盐水;于涂抹后1、24、48及72 h观察2组大鼠涂敷区皮肤是否出现红斑、水肿等刺激反应.重复给药毒性试验选择32只新西兰白兔建立皮损模型,随机均分为实验组与空白对照组,前者每天涂抹复水化FDP 0.6 mL/次,后者每天涂抹生理盐水0.6 mL/次,连续涂抹28 d,观察1次/d,测体重1次/周,于涂敷前及涂敷d7、d14、d21、d28分别采集动物血样检测血常规和相关生化指标,并取涂敷区皮肤组织行组织病理学检查.结果 单次皮肤刺激试验:2组大鼠皮肤均未出现水肿、红斑等刺激反应.重复给药毒性试验:试验周期中2组动物均未出现体重减轻、一般行为异常及死亡,体重、血常规及生化指标检测结果相近(P＞0.05),FDP组动物在实验d7 d14、d21及d28的WBC(×109/L)分别为12.20±1.28vs8.63±1.71vs6.90±1.21vs7.60±1.36(P ＜0.05);2组动物组内不同时间点的Cr波动明显(P＜0.01).组织病理学检查:2组受试动物涂敷区局部皮肤未见明显组织病理学改变.结论 FDP对实验动物没有明显的刺激反应,对动物局部损伤皮肤连续涂敷28 d未见明显毒性反应,其作为外敷生物制剂的初步安全性评价合格.
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冻干血小板运用于SD大鼠出血模型止血效果的初步研究
目的 观察冻干血小板(FDP)对SD大鼠肝出血模型和股静脉出血模型的止血效果.方法 将30只SD大鼠分别标号后随机分成3组,每组10只,分别为FDP组,云南白药组,空白对照组,每只大鼠均制作肝损伤出血和股静脉出血模型.以止血时间和出血量为监测指标,观察FDP的止血效果.结果 方差分析结果显示,在肝损伤出血和股静脉出血模型中,FDP组的止血时间和出血量均明显少于空白对照组,差异具有统计学意义(P ＜0.01);FDP组与云南白药组比较,2组间的止血时间和出血量均无统计学差异(P＞0.05).结论 FDP具有稍优于与云南白药的止血作用,将来它有可能作为1种止血药应用于临床.
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冻干血小板制备技术的研究要点
本文介绍了近年来冻干血小板制备过程中几个关键问题的研究进展,包括冻干前预处理时不同保护剂、激活抑制剂,冻干过程中参数和冻干后复水方式的技术要点,及冻干血小板在应用方面的初步进展.
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冻干血小板在促SD大鼠急性创面愈合中的实验研究
目的 建立SD大鼠急性创伤模型, 探讨冻干人血小板 (Freezing-dried Platelets, FDP) 对SD大鼠急性创伤的促愈合作用.方法 SD大鼠60只, 在每只大鼠背部脊柱两侧各剪下2个直径为1.2 cm的圆形全层皮肤.将每只大鼠背部4个创面分配到4个组:FDP组、新鲜血小板 (platelet rich plasma, PRP) 组、重组型人表皮生长因子 (Recombinant human epidermal growth factor, rh EGF) 组和空白对照组 (blank control, BC) .分别于造模后即刻给予FDP (0.85 m L/cm2) 、PRP (0.85 m L/cm2) 、rh EGF (0.5 m L/cm2) 和凡士林纱布进行治疗, 每间隔两天清洗伤口后更换敷料.于d5、d7、d10、d14肉眼观察、拍照, 并记录创面愈合情况, 计算创面愈合率, 取各时间点创缘新生皮肤组织进行HE染色、Masson三色染色和CD34免疫组化三项病理学实验, 并进行相关统计分析.结果 肉眼观察各组大鼠创面均随治疗时间延长而趋于缩小, 4个重点观测点得出的综合创面愈合率排序为PRP＞FDP＞rh EGF>BC组.治疗d5的创伤愈合率相近, 没有显著差异;d7, PRP组、FDP和rh EGF组的愈合率均高于BC组, 差异有统计学意义 (P＜0.05), 前三组组间差异没有统计学意义 (P＞0.05);d10时, 前3组的愈合率均高于BC组, 差异有统计学意义 (P＜0.05);组间比较, PRP组创面愈合率高于FDP和rh EGF组 (P＜0.05) .d14, 组间的创面愈合率没有明显差异.3种组织细胞学观察炎性细胞浸润、胶原纤维生成、血管生成增生和再上皮化等病理结果显示:FDP与PRP同样能缩短创伤愈合炎症期、促进胶原纤维的生成、加快血管生成、促进肉芽组织生长, 从而促进急性创伤组织的修复作用.结论 FDP具有与新鲜血小板相近的促进SD大鼠急性创面愈合的作用, 并具有优于单一生长因子 (rh EGF) 的促愈合效果.
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血小板冻干过程对其生长因子释放量和促HUVECs增殖作用影响的实验研究
目的 探讨血小板冻干过程对其释放PDGF-BB、TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I和FGF-b 6种生长因子及其促HUVECs增殖作用的影响.方法 采用ELISA法检测冻干前新鲜PRP激活上清液和FDP激活上清液中6种生长因子的含量.用含不同浓度的FDP激活上清液、新鲜PRP激活上清液和FBS的培养基分别培养HUVECs, CCK8法检测HUVECs增殖的状态.结果 FDP上清液中TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I和FGF-b含量均高于新鲜PRP激活上清液, 差异均有统计学意义 (P＜0.05);而PDGF-BB含量略低于新鲜PRP激活上清液, 差异无统计学意义 (P＞0.05) .FDP激活上清液、PRP激活上清液和FBS均可促进HUVECs的增殖;随着FDP和PRP激活上清液浓度的增高, 细胞增殖作用反而降低, 差异有统计学意义 (P＜0.05);在5％的浓度条件下, 培养48 h, FDP激活上清液促进HUVECs增殖作用高于PRP激活上清液和FBS, 差异有统计学意义 (P＜0.05);培养24 h和72 h, FDP激活上清液、PRP激活上清液和FBS促进HUVECs增殖作用无统计学差异 (P＞0.05) .结论 FDP具有优于新鲜PRP释放生长因子的能力;FDP激活上清液促HUVECs增殖作用优于PRP激活上清液, 与FBS具有可比性.
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冻干血小板对SD大鼠烫伤创面的修复作用研究
目的 探讨冻干血小板对SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型创面愈合的影响.方法 将40只SD大鼠(雄性)随机分成4组(n=10):冻干血小板(FDP)组、新鲜血小板(FPRP)组、烫伤膏组、生理盐水组.采用煮沸砝码加压法建立大鼠深Ⅱ度烫伤模型,分组给药,1次/d,连续20 d.记录动物烫伤模型创面愈合情况并做组织学检查.结果 给药至d7,4组大鼠烫伤创面愈合率分别为:FDP组(41.27±5.90)％、FPRP组(41.62±13.93)％、盐水组(33.52±14.58)％、烫伤膏组(33.58±10.89)％,FDP组和FPRP组创面愈合率明显高于烫伤膏组和生理盐水组(P＜0.05);病理组织学检查:给药d7、d21,冻干组和新鲜组对大鼠烫伤创面皮肤病理的修复作用明显优于烫伤膏组及盐水组,而这2组血小板组间比较无明显差异.结论 冻干血小板促进大鼠烫伤模型创面早期愈合作用与新鲜血小板相近.
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冻干血小板和冻干冷沉淀在新西兰白兔耳动脉出血中的应用分析
目的 建立新西兰白兔耳动脉出血动物模型,探讨冻于血小板(FDP)和冻干冷沉淀(FDC)在新西兰白兔耳动脉出血中的止血效果.方法 新西兰白兔32只,随机分为4组:FDP组、FDC组、冻干血小板及冻干冷沉淀联合组(FDPC)及空白对照组(BC),每组8只,建立耳动脉出血模型,并将止血材料敷于新西兰白兔出血创面,观察各组的止血时间及失血量.结果 对于耳动脉出血,各组均可止血,FDP组、FDC组及FDPC组的止血时间和出血量均明显少于BC组,差异有统计学意义(P＜0.05);而FDP组与FDC组间止血时间及失血量差异显著(P＜0.05);与单独使用FDP或FDC相比,FDPC组止血时间显著性缩短,失血量明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 FDP和FDC联合使用对新西兰白兔耳动脉出血具有更显著的止血效果.
