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以转染白血病抑制因子基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞
目的 以转染白血病抑制因子(LIF)基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞,为建立无动物成分污染的人胚胎生殖细胞培养体系奠定基础.方法 将LIF真核表达载体pcDNA3.1(+)-LIF转染到人胚肺成纤维细胞中,通过筛选和鉴定获得表达LIF的阳性细胞.将原始生殖细胞(PGCs)种植到转染后细胞制备而成的饲养层上,在不添加外源性LIF的条件下培养,并对PGCs来源的细胞集落进行鉴定.结果 经RT-PCR及Western blotting 鉴定证实,转染pcDNA3.1(+)-LIF的人胚肺成纤维细胞表达LIF基因.在转染后人胚肺成纤维细胞上生长的PGCs可形成典型的鸟巢状集落,经检测集落碱性磷酸酶活性呈强阳性,表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,及未分化标志Oct-4.结论 用转染LIF基因后的人胚肺成纤维细胞作为饲养层能支持PGCs来源人胚胎生殖细胞的生长,维持自我更新.
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胚胎干细胞的生物学特性及其应用
1981年Evans和Kaufman首次建立了小鼠胚胎干细胞系[1].关于人的胚胎干细胞早文献记载是在1994年,ES细胞是从人胚泡的ICM中分化而成的,但只传了二代未能建系成功[2].1998年JamesThomson等[3]从人胚泡的ICM分离出ES细胞并建系成功;同年JohnGearhart等[4]从5～9W流产的胎儿生殖嵴中分离出人胚胎生殖细胞(embryonic germcell,EGC),这些都为ES细胞的研究奠定了基础.由于ES细胞具有全能分化潜能和无限扩增能力,在体外可分化成各种细胞和组织用于进行替代治疗,因此ES细胞成为21世纪生命科学研究领域的热点之一.现将胚胎干细胞的生物学特性以及应用进展进行综述.
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人胚胎成纤维细胞的分离、培养和鉴定及人胚胎生殖细胞体外生长所需细胞因子的表达
目的:从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中分离、培养及鉴定人胚胎成纤维细胞(hEFs),检测hEFs表达人胚胎生殖细胞(hEG)体外生长所需的重要细胞因子.方法:利用酶消化法从孕5～9周龄人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中分离培养hEFs,检测其生物学特性(细胞形态、细胞生长特点、细胞周期).采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测hEFs表达成纤维细胞特异性标志(脯氨酰4-羟化酶β亚单位)和上皮细胞特异性标志(细胞角蛋白4)的情况,对该细胞进行鉴定.应用RT-PCR检测hEG生长所需的重要细胞因子的表达,即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF).结果:从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中成功地分离培养出hEFs,该细胞可传25代以上,且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变;hEFs表达脯氨酰4-羟化酶β亚单位,不表达细胞角蛋白4,确定其为成纤维细胞;该成纤维细胞表达bFGF和LIF.结论:成功地分离和培养了人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维细胞,证明其表达对于hEG体外生长起重要作用的细胞因子.
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人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维样细胞作为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞方法的建立
目的:研究以来源于人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜的成纤维样细胞为饲养层,体外培养人胚胎生殖细胞(hEG).方法:分离培养孕5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中的成纤维样细胞,以该细胞作为饲养层,体外原代培养来源于孕5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜组织的hEG.免疫荧光染色法、碱性磷酸酶染色法和体外分化实验用于鉴定所培养的hEG.结果:成功分离培养人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维样细胞,可传至25代以上,并保持状态稳定,3～15代人胚胎成纤维样细胞用于制备饲养层.21例hEG原代培养中,有7例获得明显增殖的hEG细胞集落,目前传到第10代,仍然保持碱性磷酸酶、胚胎阶段性表面抗原(SSEA)-1、SSEA-4和POU转录因子Octamei-4(Oct-4)的表达为强阳性,并具有向3个胚层细胞分化的能力.结论:成功利用人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜的成纤维样细胞作为饲养层细胞,获得了能够增殖并保持未分化状态和多向分化潜能的hEG,建立了一种新的hEG培养方法,为hEG的体外培养建系奠定基础.
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人胚胎生殖细胞移植治疗猪心肌梗死
目的:研究人胚胎生殖细胞(EG细胞)移植猪心肌梗死区存活及心肌再生作用.方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴,采用组织块培养法体外培养获得人胚胎生殖细胞.取太湖小型猪2只,分移植组和对照组,开胸结扎冠状动脉左前降支制作心肌梗死模型.术后2周处死猪,取出心肌组织,以鼠抗人细胞核抗体MAB1281作为示踪剂,免疫组织化学检测移植细胞的存活情况;并观察转录因子GATA-4、连接蛋白Cx43、心肌转录因子NKx-2.5和心肌肌钙蛋白T(cTnT)在移植猪心组织的表达.结果:成功地建立猪急性心肌梗死模型,结扎冠脉后可见心电图典型的心肌梗死变化;免疫组织化学显示移植组MAB1281阳性细胞,GATA-4、Cx43、Nkx2.5和cTnT均阳性表达.结论:人EG细胞移植于此模型的心肌组织中不仅存活,而且能向心肌细胞分化,具有心肌再生能力.
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人胚胎生殖细胞体外培养条件优化及细胞移植实验研究
目的:优化人胚胎生殖细胞(EG细胞)的体外培养体系,并将生长状态良好的传代的人EG细胞移植用于大鼠心肌梗死模型的治疗.探讨人胚胎生殖细胞进行异种移植对大鼠心肌梗死的治疗机制.方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,用添加和不添加细胞因子的两种培养体系对比进行组织块原代及传代培养,选取生长情况良好的传至第4代的人EG细胞,移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌周围,分别于移植后1天、1、2、4周处死大鼠,以鼠抗人细胞核抗体MAB1281作为示踪剂[1],通过免疫组化方法检测移植细胞的分布.结果:在培养液中添加LIF和b-FGF后原代及传代培养的人EG细胞生长旺盛,形成集落更早,传到第4代形成的集落体积变化不大;移植组人EG细胞在移植后1天、1周、2周、4周均可以在心梗区域观察到MAB1281阳性细胞.结论:添加LIF和b-FGF的培养体系是更高效的人EG细胞培养体系.人EG细胞可异种移植,人EG细胞在大鼠心肌梗死处由心外膜层逐渐向心肌层迁移.
关键词： 人胚胎生殖细胞 白血病抑制因子 碱性成纤维细胞生长因子 心肌梗死 细胞移植 -
人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化的研究
目的 诱导人胚胎生殖细胞(hEGC)向心肌细胞分化,初步探讨其定向分化过程及调控机制.方法 组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过CCK-8法测定诱导后心肌细胞增殖率,免疫荧光法检测心肌连接蛋白Cx43的表达；利用半定量RT-PCR的方法鉴定hEGC和诱导后心肌细胞GATA-4和ACTC1等基因的表达；结合生物信息学方法推断分化过程中各蛋白的相互作用关系.结果 诱导后细胞阳性表达Cx43,且表现出一定的增殖能力；其表达GATA-4、ACTC1等基因的强度与未经诱导的hEGC均有所不同；GATA-4、Nkx2.5与各类心肌肌钙蛋白有着密切的联系.结论 hEGC能诱导分化为心肌细胞；蛋白质组学方法可以协助探讨其分化过程及调控机制.
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人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析
目的 分析人胚胎生殖细胞(hECC)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变.方法 组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过免疫荧光法检测诱导后细胞中肌钙蛋白T(cT-nT)的表达；分别提取hEGC及诱导分化2周后的细胞总蛋白,采用iTRAQ标记、液相色谱(LC)分离总蛋白,串联质谱(MS/MS)鉴定差异蛋白.结果 诱导后细胞阳性表达cTnT;通过质谱分析和数据库搜索共鉴定出349种蛋白,其中27种蛋白差异显著.结论 hEGC能诱导分化为心肌细胞:蛋白质组学方法可以高通量筛选hEGC向心肌细胞分化相关的重要蛋白.
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人胚胎生殖细胞移植于梗死心肌后不同时期心肌特异转录因子GATA-4的表达
目的:探讨人胚胎生殖细胞(hEGCs)移植入急性心肌梗死大鼠心肌组织后,移植细胞早期心肌特异转录因子GATA-4的表达.方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,进行人EG细胞的组织块原代及传代培养,以传四代的人EG细胞为移植细胞.40只SD大鼠随机分为两组,移植组将获得的人EG细胞移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌边缘;对照组用同样的方法给急性心肌梗死大鼠注入PBS.于移植后1天,1、2、4周处死大鼠,用免疫组化方法检测心肌特异转录因子GATA-4在移植细胞的表达.结果:移植后1天,1、2、4周移植组均有移植细胞稳定存活,GATA-4的表达在移植1天时呈弱阳性,1周及2周时呈阳性,4周时强阳性;对照组均未检测出移植细胞及心肌细胞转录因子.结论:随着移植时间的延长.移植细胞GATA-4表达呈增强趋势,移植后4周表达强度大.
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胚胎干细胞研究进展
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是由动物或人囊胚的内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离出来,经体外分化抑制培养筛选出的具有全能性的胚胎细胞.经适当的因子诱导,ESCs可以分化成一种或多种细胞类型.自1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman等用不同的方法成功地分离、建立了小鼠ESCs系以来[1],历经将近20年,第一株人ESCs系在美国威斯康星大学成功建立[2].同一年,另一研究小组用流产胎儿性腺成功地分离和培养并建立了人胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs)系[3].有人将二者统称为ESCs系.这一成就在世界范围内掀起了ESCs研究热潮,研究者们相信ESCs将会给移植治疗、药物发现及筛选、细胞及基因治疗和生物发育的基础研究等带来深远的影响,打开在体外生产所有类型的可供移植治疗的人体细胞、组织乃至器官的大门.本文就近几年来ESCs在体外培养、分化和应用方面的研究进展作一回顾.
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人胚胎生殖细胞饲养层的制备
目的:建立稳定高效的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts,HFF)饲养层培养体系,用于培养人胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EGCs).方法:取4～5岁小儿包皮,采用机械法和组织消化法分离、培养成纤维细胞,倒置相差显微镜观察细胞生长状况,免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术检测细胞纯度、生长曲线及细胞周期,筛选丝裂霉素C作用的佳浓度和时间.分离5～11周人胚胎原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)并培养于经丝裂霉素C处理的HFF饲养层上,观察人EGCs生长情况.结果:机械法和组织消化法结合分离HFF方法可靠,纯度高,细胞生长活性好,能快速进入对数生长期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致,细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;丝裂霉素C抑制细胞增殖的适宜浓度及时间为12.5 mg/L作用2.5 h;分离的人PGCs在该饲养层上培养可形成典型的EGCs集落,体外连续培养超过3代.结论:HFF饲养层能有效地支持人EGCs的生长.
