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人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立
目的 探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法.方法 利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐( VPA)诱导人包皮成纤维细胞为多能性干细胞.通过碱性磷酸酶(AKP)染色及免疫荧光细胞化学方法,检测人胚胎干细胞多能性标记物在所建立的诱导多能性干细胞(iPSCs)中的表达,RT-PCR检测拟胚体(EB)三胚层特异基因的表达.结果 以GFP作为指示,建立了高效的反转录病毒感染体系,将人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs;所建立的iPSCsAKP染色阳性,表达人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、TRA-1-60和TRA-1-81,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达；小分子物质VPA的添加并未显著提高重编程效率.结论 在GFP所指示的佳病毒感染剂量下,联合小分子物质VPA成功建立了人包皮成纤维细胞来源的iPSCs.
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用包皮成纤维细胞培养弓形虫速殖子的研究
目的建立用包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts, HFF)培养弓形虫速殖子的方法. 方法将包皮环切术切下的包皮在含青、链霉素的Hank's液中充分洗涤后,用眼科剪子剪成0.5 cm3的组织小块,移入培养瓶中培养,待HFF细胞长满瓶底后,用胰酶消化并将其接种到培养皿中的盖玻片上培养, HFF长满盖玻片后,用弓形虫速殖子感染HFF,镜下观察并于1、2.5、4、5.5、10、23和32 h取出其中一皿中的盖玻片,经姬氏染色、二甲苯透明后,镜下观察速殖子生长情况. 结果弓形虫速殖子大多在感染后 3 h～5 h侵入HFF,32 h左右,假包囊破裂,释放出虫体. 结论成功建立了用HFF培养弓形虫的方法.
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不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用
目的 比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异.方法 分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定.结果 3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大.3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性.MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P<0.01).hMSC支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P<0.01).结论 3种滋养层细胞均可支持hESC的正常生长.MEF有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础.在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF.
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抗衰老与去衰老的研究与应用
抗衰老技术(technology of anti-aging)是在衰老生物学(biology of aging)基础研究之上发展起来的.从不同的衰老学说出发进行研究,都有可能获得成功.从衰老的氧化学说出发,Lang等[1]发现,羧酸噻唑烷镁(MgTC)能大大提高果蝇、蚊子、小鼠的谷胱甘肽(GSH)含量和延长寿命.从衰老的端粒学说出发,Bodnar等[2]将端粒酶亚单位hTRT基因通过载体转入视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞,大大扩展了这两种细胞的复制寿命.从衰老的基因学说出发,Rogina等[3]发现,用P-element适当插入Indy基因,雄雌果蝇平均寿命增长约1倍(37～70d),高寿命增加了50%.上述的研究结果都有可能发展为抗衰老的药物干预或技术干预.鉴于这方面国内已有很多报道,本文不再赘述.
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银杏酸、阿奇霉素和大蒜素抗弓形虫增殖效果研究
目的 评价银杏酸、阿奇霉素和大蒜素体外和体内抗弓形虫增殖的效果.方法 体外试验,培养HFF细胞做为弓形虫宿主细胞,采用MTT法检测3种药物的安全浓度和体外抗弓形虫增殖的效果.体内试验,以腹腔注射的方式给药,观察感染弓形虫小鼠的存活时间,比较3种药物的体内抗弓形虫增殖效果.结果 银杏酸和阿奇霉素可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,两者效果相近.银杏酸和阿奇霉素均可延长小鼠存活时间.大蒜素抗弓形虫效果微弱.结论 银杏酸具有抗弓形虫作用.
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脐带血血浆对包皮成纤维细胞生长影响的实验研究
目的 探讨人脐带血血浆(HUP)能否维持人包皮成纤维细胞(HFF)的生长.方法 将脐血浆经盐析、透析等处理后,按10％体积成分培养HFF,并与同样浓度的胎牛血清(FBS)进行比较,观察 细胞的贴壁速度、生长曲线、细胞周期及增殖能力. 结果 HFF在含10％HUP的培养液中能长期生长,其生长生长形态、细胞增殖能力及特征都与在含同体积FBS的培养液中无显著差异.结论 人HUP能维持HFF的长期生长.
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包皮成纤维细胞的生物学特性研究
目的:探讨人包皮成纤维细胞的生物学特性,为人胚胎生殖细胞(Human embryonic germ cells,hEG cell)长期体外培养打下基础.方法:探索分离包皮成纤维细胞的方法;采用免疫细胞化学法、MTY法、流式细胞术等对人包皮成纤维细胞进行生长形态观察.纯度鉴定,生长曲线及细胞周期检测,并就不同浓度丝裂霉素作用不同时间对人包皮成纤维细胞生长的影响进行研究.结果:0.25%胰酶,4℃消化过夜(12-16h)较37℃,5%CO2孵育2h更容易分离表皮和真皮;包皮成纤维细胞波形蛋白染色呈强阳性,纯度达95%以上;细胞生长曲线没有明显的滞留期,在1～6 d处于快速增殖期,第7d开始处于平台期;细胞周期大多数处于G0/G1期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致.丝裂霉素抑制包皮成纤维细胞增殖的适宜浓度及时间为12.5μg/ml作用2.5h.结论:包皮成纤维细胞的生物学特性表明其可以作为人EG细胞长期体外培养的饲养层.
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人胚胎生殖细胞饲养层的制备
目的:建立稳定高效的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts,HFF)饲养层培养体系,用于培养人胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EGCs).方法:取4～5岁小儿包皮,采用机械法和组织消化法分离、培养成纤维细胞,倒置相差显微镜观察细胞生长状况,免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术检测细胞纯度、生长曲线及细胞周期,筛选丝裂霉素C作用的佳浓度和时间.分离5～11周人胚胎原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)并培养于经丝裂霉素C处理的HFF饲养层上,观察人EGCs生长情况.结果:机械法和组织消化法结合分离HFF方法可靠,纯度高,细胞生长活性好,能快速进入对数生长期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致,细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;丝裂霉素C抑制细胞增殖的适宜浓度及时间为12.5 mg/L作用2.5 h;分离的人PGCs在该饲养层上培养可形成典型的EGCs集落,体外连续培养超过3代.结论:HFF饲养层能有效地支持人EGCs的生长.
