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牙胚细胞联合骨髓液及生物工程材料促进牙齿再生的动物实验研究
目的 观察牙胚细胞联合骨髓液及生物工程材料促进牙齿再生情况.方法 80 只大鼠随机分为四组,实验后收集X 线数据、组织学分析结果和免疫组织化学分析结果并加以比较.结果与其余三组相比,试验组大鼠牙齿生长评分情况明显优于假治疗组(P<0.05),差异具有统计学意义.组织学HE 染色结果显示20 例大鼠均有新生时期细胞的胞浆,18 只大鼠的免疫组织化学分析分析结果为阳性.结论牙胚细胞能够重新进入牙生成程序中并参与牙齿的形成,因此这些细胞可以成为牙齿再生的来源.
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牙胚细胞体外培养过程中成牙基因的表达
背景：多项实验表明牙胚组织在不同的时间点有不同的基因发挥作用，共同促进牙胚发育。
目的：观察牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1在大鼠牙胚细胞体外培养的不同时间的表达。
方法：对体外培养后第1，3，6天的牙胚细胞提取RNA，反转录后采用实时定量PCR的方法检测牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1mRNA相对表达水平的变化。
结果与结论：牙胚细胞中牙本质基质蛋白1、成釉蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达随培养时间的延长而增加，在培养3 d时达到峰值(P<0.05)，而同源异型盒基因1 mRNA的表达随培养时间的延长而下降(P<0.05)。 -
胎鼠牙胚细胞体外培养研究
目的摸索正常胎鼠牙胚细胞离体培养所需条件,为进一步将其作为牙组织工程种子细胞奠定基础.方法体视显微镜下取17d龄胎鼠下颌第一磨牙牙胚,胶原酶/分离酶消化,以含10%胎牛血清(FCS)的DMEM为培养基进行原代培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长特点,MTT法测定细胞活性绘制生长曲线,取原代培养4～9d的细胞进行组织化学和免疫组织化学染色.结果倒置显微镜下观察,培养细胞在24h内贴壁,约7～9d生长连成片状,细胞有多角形、大而扁平梭形和长梭形几种形态.生长曲线表明:培养细胞在前3天生长缓慢,第4天呈对数生长,第7天达高峰.免疫组化结果表明:培养细胞来源于两种组织.结论采用酶消化培养法,用胶原做基质饲养层,含10%FCS的低糖DMEM作为培养基,能将胎鼠牙胚细胞培养成活,并维持其细胞学特征.
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RFP标记及bFGF/BMP-2信号诱导的牙组织工程的体内实验研究
目的 RFP标记的牙胚细胞和bFGF/BMP-2转染的骨髓间充质干细胞混合培养,复合3D打印聚乙烯醇(PVA)/双相陶瓷骨支架(DCCP)材料构建牙组织工程的体内孵育,探究其分化能力.方法 取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;PVA/DCCP支架材料组;细胞团块+PVA/DCCP支架材料组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下.术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行免疫组化染色和激光共聚焦切片观察.结果 免疫组化:析因分析显示细胞团块+PVA/DCCP支架材料组在5、10 d DMP-1、BMP-4表达量高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义P<0.05;DSP在各组各时间点均为阴性表达,差异无统计学意义P>0.05.激光共聚焦显微镜显示:细胞团块+ PVA/DCCP支架材料组各时间点切片组织中都可观测到荧光标记的牙胚细胞.结论 RFP 标记的牙胚细胞和bFGF/BMP-2转染骨髓间充质干细胞混合培养,复合PVA/DCCP支架材料,构建牙组织工程成活并分化,其分化机制有待进一步研究.
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基于牙胚细胞的组织工程化牙齿研究进展(综述)
牙齿组织工程是近年来口腔医学领域的热点,随着组织工程、材料学、纳米技术和干细胞等技术的发展,在组织工程化牙齿的研制方面已经取得了一些突破性进展,该文就基于牙胚细胞的组织工程化牙齿的研究现状、目前的研究目标等方面作一综述.
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bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究
目的:牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogeneticprotein 2 BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力.方法:取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块十明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下.术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色.结果:大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28 d形态学观察显示细胞团块十明胶海绵组形成牙样组织.免疫组化:析因分析显示细胞团块十明胶海绵组在5、10、14 d DMP-1、BMP-4、DSP表达量高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础.
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牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究
目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4 (BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用.方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1:1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化.结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞.
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混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞与支架材料复合成牙的体内研究
目的:研究经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与骨形态发生蛋白2(BMP-2)混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内环境中与不同支架材料复合后的成牙潜能.方法:将取自SD大鼠的BMSCs与牙胚细胞在bFGF和BMP-2混合信号诱导的微环境中共培养后分别接种于明胶海绵和3D打印的PVA/DCCP复合支架材料上,然后回植入同种异体大鼠肾被膜下.在回植后的第1、3、7、14、28天采集回植体样本,用实时定量PCR (RT-PCR)检测各组样本成牙相关基因成釉蛋白(AMBN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ)、以及同源异型盒基因1 (DLX1) mRNA水平.结果:各基因在不同时间点的表达量与完整牙胚(E组)均存在统计学差异(P＜0.05);上述4个成牙相关基因的表达水平在不同支架材料组之间具有显著性差异(P＜0.001);不同成牙诱导信号对各个基因的表达水平也有一定影响.结论:在体内模拟环境下,经bFGF与BMP-2混合信号诱导的大鼠BMSCs与3D打印支架材料复合后能提高成牙基因的表达水平,促进牙体组织的形成.优选支架材料并构建合适的组织工程牙模型对实现非牙胚源性细胞向牙源性细胞的转化同样具有重要意义.
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牙胚细胞的分离培养
目的:分离培养牙胚细胞.方法:选择出生后(PN)8天的SD大鼠,从第一磨牙牙胚上撕脱牙囊和成釉器组织,切取牙胚颈部组织,剥离牙乳头组织,分别进行细胞培养,通过差速消化法分离各种牙胚细胞.结果:牙囊、牙乳头、成釉器和上皮根鞘细胞被分离纯化出来.结论:利用差速消化法可同时分离培养4种主要的牙胚细胞.
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抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用
目的克隆PAK5-N端基因并诱导其表达,进行多克隆抗体制备,为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础.方法根据人全长PAK5 cDNA序列,设计引物;利用PCR技术,以PAK5全长cDNA为模板扩增PAK5-N端基因,将扩增产物克隆至pGEX-4T-1载体中,经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA测序.以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆菌BL21中表达.利用GST融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化,通过免疫家兔制备多克隆抗体,并在牙胚细胞中进行了初步研究.结果和结论成功克隆了PAK5-N端基因,在E.coli中表达了PAK5-NT,并纯化了GST融合蛋白,制备了PAK5特异性抗体.Westernblotting表明PAK5在牙胚细胞中过度表达,为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据.
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体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响
目的 利用牙胚细胞(TGC)作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞(DPSC)、外胚间充质干细胞(EMSC)分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力.方法 利用出生后4d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白(DSP)的表达和碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力.结果 共培养7d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组(P＜0.05).免疫组化染色图像分析结果表明共培养7d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著(P＜0.05).共培养组3、7d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高.结论 混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC.
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骨形成蛋白-2和牙胚细胞联合作用诱导人牙周膜干细胞表达成牙骨质细胞的表型研究
目的:探讨大鼠牙胚细胞(Tooth germ cells,TGC)与骨形成蛋白-2 (Bone morphogenetic proteins-2,BMP-2)联合作用对人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)向成牙骨质细胞表型分化的作用.方法:将免疫磁珠法分离的hPDLSCs与TGC共培养,并加入50ng/mL的BMP-2,通过RT-PCR,茜素红染色和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测等方法分析其相关成牙骨质基因及蛋白的表达变化.结果:诱导后hPDLSCs的ALP活性明显升高(P＜0.001),牙骨质细胞相关基因如牙骨质附着蛋白(Cementum attachment protein,CAP)、牙骨质蛋白(Cementum protein1,CEMP-1)、ALP,骨钙素(Osteocalcin,OCN)的转录水平表达量均有不同程度的增高(P＜0.001).矿化诱导14d后,诱导组形成大量矿化结节,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.001).结论:TGC与BMP-2联合作用能够诱导hPDLSCs与向成牙骨质细胞的表型分化.
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不同直径牙胚细胞增殖和骨向分化能力的评估
目的：比较大鼠不同直径牙胚细胞增殖和骨向分化能力的差异。方法：酶消化法分离、培养SD大鼠牙胚细胞，经13μm标准细胞筛分选后获得大、小2种直径的细胞；并分别采用MTT法检测2种细胞的增殖能力；碱性磷酸酶（ ALP）试剂盒、茜素红染色法及qRT－PCR检测两者的骨向分化能力。结果：小细胞的增殖能力较低（P＜0．05）；培养3、7 d后，小细胞组的ALP活性均明显高于大细胞组（P＜0．05）；培养14 d后，小细胞组钙化结节数量明显高于大细胞组；qRT－PCR检测结果显示，小细胞组中Ocn、Osx、Runx2各矿化相关基因的表达水平均明显高于大细胞组（P＜0．05）。结论：牙胚细胞中直径小于13μm 的细胞比直径大于13μm的细胞增殖活性低，分化能力强。
