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人牙髓细胞骨基质蛋白表达的研究进展
骨基质蛋白在骨骼和牙齿形成,以及损伤修复过程中起着重要作用.本文对骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质磷蛋白(DPP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达,以及在牙齿形成、损伤修复,对组织工程中成骨组织作用等研究进展进行了概述.
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钟状期牙胚来源的猪牙乳头细胞培养
目的 观察新生猪牙胚的发育情况并培养猪牙乳头细胞,对传代细胞的生物学特性进行研究.方法 选择3日龄新生猪,分离牙胚,通过组织学、免疫组化等研究牙胚的发育情况.分离牙乳头组织,酶消化法培养牙乳头细胞并鉴定;观察细胞生长特性,通过牙本质涎蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原免疫组化染色比较体内外细胞的生物学性状.结果 新生猪磨牙尚未萌出,其中第二磨牙为典型的钟状期牙胚.分离培养的牙乳头细胞在体外生长良好,经鉴定细胞来源于间充质组织,免疫组化表明,牙本质涎蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性,Ⅲ型胶原表达阴性.结论 新生猪可以提供处于钟状期的牙胚,通过酶消化法可成功培养猪牙乳头细胞,第3代细胞的生物学特性与体内细胞有一定相似性,可用于进一步深入研究.
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牙本质涎蛋白转基因小鼠的构建
目的构建小鼠牙本质涎蛋白(DSP)转基因小鼠.方法将pcDNA3.1载体中的CMV启动子替换为启动子cβ-actin,构建载体pcDNA3.1-CX,然后将PCR获得的DSP基因编码序列克隆到pcDNA3.1-CX中,构建DSP转基因载体pcDNA3.1-CX-dsp;将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,受精卵移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生后,用PCR及Southern blot检测阳性小鼠.结果共移植717枚注射过的受精卵至29只受体鼠,移卵后产仔67只,阳性4只.阳性鼠分别传代,开始建系.结论通过显微注射的方法成功获得了DSP转基因小鼠.
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改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞
背景:乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量.目的:比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性.方法:取无龋滞留乳切牙12颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34和CD45的表达.细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能.结果与结论:两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义(P＜0.05)；牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达.然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义(P＞0.05).说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法.
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低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达
背景：以往研究用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度，其他浓度的诱导情况尚无相关研究。目的：观察在低浓度β-甘油磷酸钠条件培养下，牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中，牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况。方法：分离培养人牙髓干细胞，用不同浓度的诱导液诱导牙髓干细胞分别向脂肪细胞，成骨细胞分化，证实其多向分化能力。用5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养牙髓干细胞向牙本质细胞分化，分别在培养第7，14，21，28天提取各组细胞RNA，反转录PCR检测牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况；诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化形成的矿化结节用Alizarin Red S法检测。结果与结论：人牙髓干细胞经过诱导可证实其成功分化为脂肪细胞和成骨细胞；反转录 PCR 结果显示，5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞在培养7，14，21 d，各组细胞牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白的mRNA表达增加，伴随细胞外基质磷酸糖蛋白表达下调；培养至28 d，行矿化结节检测发现牙髓干细胞向成牙本质细胞成功矿化，可见红染的矿化结节。结果证实，5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养的牙髓干细胞可成功分化为成牙本质细胞，并下调细胞外基质磷酸糖蛋白mRNA的表达，同时上调牙本质基质蛋白1及牙本质涎蛋白mRNA的表达。
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不同年龄段牙髓组织比例及牙髓干细胞分布的实验研究
目的 通过观察不同年龄段前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齿的比例,及干细胞分布情况,评估牙齿组织工程临床适宜的选材标本.方法 临床收集不同年龄段因正畸或其他原因拔除的无龋坏、无牙周疾病等的健康前磨牙及第三磨牙,分别称重牙齿及牙髓并计算比例.扫描电镜观察牙髓表面形态.脱钙后病理切片观察,牙髓组织内成牙本质细胞层完整与否,观察细胞与纤维成分比例;阿尔新蓝-希尔红染色,偏振光显微镜观察有无双折射现象；免疫组化染色观察,间充质干细胞特异性标记物STRO-1以及成牙本质相关蛋白牙本质涎蛋白DSP的表达情况,评估牙髓干细胞在牙髓组织中的分布情况.结果 随着年龄的增长,前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齿比例逐渐缩小,11～20岁年龄段与31～40岁、41～50岁,以及50岁以上年龄段比较,有统计学差异.扫描电镜下可见摘除的牙髓组织类似树桩,有些区域比较平滑,有些区域表面有不规则突起.牙髓组织内存在双折射.STRO-1阳性表达细胞在牙髓组织中散在分布,在血管周围较密集.DSP表达则主要集中在牙本质区域及成牙本质细胞内,牙髓内仅有少量表达.结论 随着年龄的增长,牙髓逐渐萎缩,牙髓干细胞的分布集中于血管周围,在牙髓组织内散在分布,未分化的牙髓干细胞不表达成牙本质相关蛋白DSP.
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猪牙乳头细胞的体外培养及生物学特性研究
目的:培养新生猪的牙乳头细胞,探讨其传代细胞的生物学特性.方法:选择刚出生1～3d的新生猪,取出磨牙胚,分离牙乳头,用酶消化法培养猪牙乳头细胞,并用波形丝蛋白和细胞角蛋白鉴定细胞来源.观察细胞的生长规律,通过免疫组化染色检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、牙本质涎蛋白(DSP)等的表达情况.结果:猪牙乳头细胞在体外培养时生长良好,波形丝蛋白染色阳性而细胞角蛋白染色阴性,细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、DSP呈阳性表达.结论:通过酶消化法,可以体外扩增培养猪牙乳头细胞,细胞为间充质来源,其传代细胞在合成胶原及DSP的能力上与体内牙乳头细胞相似,提示猪牙乳头细胞可能具备作为牙髓-牙本质复合体再生研究种子细胞的潜能.
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牙本质涎蛋白转基因小鼠的建立和转基因表达的初步分析
目的:构建牙本质涎蛋白(DSP)转基因小鼠,并对转基因表达进行初步RT-PCR分析.方法:将pcDNA3.1载体中的CMV启动子替换为启动子cβ-actin,构建载体pcDNA3.1-CX,然后将PCR获得的DSP基因编码序列克隆到pcDNA3.1-CX中,构建DSP转基因载体pcDNA3.1-CX-dsp;将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,将受精卵移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生后,用PCR及Southern印迹检测阳性小鼠,并用RT-PCR对其中一小鼠的F1代进行转基因表达分析.结果:共移植717枚注射过的受精卵至29只受体鼠,移卵后产仔67只,阳性4只.检测到53号小鼠F1代外源性DSP的表达.结论:通过显微注射方法,成功获得了DSP转基因小鼠,并证实外源性DSP可在53号小鼠F1代获得表达.
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成牙本质细胞的基本特征及其研究进展
成牙本质细胞作为牙髓细胞的主要成分,具有在牙发育期间和成熟牙内生成牙本质的功能.目前的研究多基于牙髓细胞的二维体外培养,随着对牙髓组织研究的不断深入,牙髓细胞体外三维立体模型的建立将是未来研究的热点.作者回顾了近年来对成牙本质细胞的研究情况,主要阐述了成牙本质细胞的形态、超微结构、功能、蛋白表达的特征及其研究进展和今后的研究方向.
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SD大鼠下颌第一磨牙DLX5、RUNX2、OSX、DSP的表达分析
目的:观察远端缺失141源盒5(distal-less homeobox 5,DLX5 )、核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)在出生后SD大鼠下领第一磨牙不同发育阶段的表达情况,探讨其在SD大鼠出生后下颌第一磨牙发育矿化的作用机制.方法:采用免疫组化法分析出生后1、7、14、28 d SD大鼠下领第一磨牙中DLX5、RUNX2、OSX、DSP的表达分布.结果:DLX5在出生后1、7、14 4中均有表达,表达量呈现出上升趋势,但是在28 d时不表达;RUNX2在出生后1、7、14、28 d均表达,表达量在7d时呈现低;OSX在出生后l,7、14、28 d均有表达,表达量在14 d时呈现低;DSP在出生后1、7、14、28 d均有表达,表达量呈上升趋势.结论:DLX5、RUNX2、OSX、DSP在大鼠出生后各阶段的表达量不同,具有时空特异性,表明DLX5、RUNX2、OSX、DSP可能对出生后SD大鼠下颌第一磨牙发育及矿化具有一定的调控作用.
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正畸牙移动致牙根吸收对龈沟液中牙本质涎磷蛋白及涎蛋白表达的影响
目的 探讨正畸牙移动致牙根吸收对龈沟液中牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质涎蛋白(DSP)表达的影响.方法 将67例正畸患者按照不同力值将其分为观察组与对照组,观察组为过大力值(300 g)组,对照组为正常力值(30 g)组,对两组患者1～12周龈沟液中DSPP、DSP表达情况进行检测.结果 观察组DSPP、DSP表达明显高于对照组,两组均在7～9周表达增加,观察组灰阶分别为(232 315±5437)、(487 876±4374)、(287 673±5642),对照组灰阶为(212 147±2346)、(176 565±5327)、(134 323±2315)；并在10周后出现降低,观察组10周以及11周灰阶为(394532±4326)、(287 674±3235)；对照组分别为(87 876±4323)、(76 534±3564),11周均较10周有明显降低.结论 在牙根吸收过程中龈沟液中DSPP、DSP表达变化可能早于X线结果以及临床表现,可能作为正畸牙移动致牙根吸收检测的早期指标.
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bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究
目的:牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogeneticprotein 2 BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力.方法:取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块十明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下.术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色.结果:大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28 d形态学观察显示细胞团块十明胶海绵组形成牙样组织.免疫组化:析因分析显示细胞团块十明胶海绵组在5、10、14 d DMP-1、BMP-4、DSP表达量高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础.
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被动吸烟对大鼠牙槽骨内DSP和OPN表达的影响
目的:观察被动吸烟对大鼠牙槽骨内牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达的影响.方法:20只6周龄健康雄性Wistar大鼠随机等分为对照组和实验组,每个大组再等分为30 d 和60 d两个亚组.采用单纯烟熏法建立大鼠被动吸烟模型,免疫组织化学法检测DSP和OPN在大鼠牙槽骨内的表达.结果:与对照组大鼠相比较,实验组大鼠牙槽骨内DSP和OPN表达均明显上调;在本实验周期内,上述变化随实验时间的延长而加重.结论:被动吸烟上调大鼠牙槽骨内矿化相关非胶原蛋白DSP及OPN的表达,推测DSP和OPN在被动吸烟抑制牙槽骨矿化的发病机制中发挥一定的作用.
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过量氟对大鼠切牙牙本质涎蛋白mRNA表达的影响
目的 研究过量氟对大鼠切牙发育过程中牙本质涎蛋白( dentin sialoprotein,DSP) mRNA表达的影响.方法 选择6只Wistar大鼠,随机分成两组:对照组常规饲料喂养,自由饮用蒸馏水；实验组常规饲料喂养,自由饮用氟离子浓度为100 mg/L的氟化水,建立大鼠氟斑牙模型.饲养8周处死动物,提取大鼠切牙组织总RNA,逆转录为cDNA,利用实时荧光定量聚合酶链反应技术观察过量氟对大鼠切牙中DSP mRNA表达的影响.结果 实时荧光定量聚合酶链反应结果显示DSP mRNA在实验组表达水平明显高于对照组表达水平(t=2.132,P＜0.01).结论 过量氟可能通过增强DSP mRNA的表达,影响牙本质的发育矿化.
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正畸牙根吸收与龈沟液中牙本质涎磷蛋白和牙本质涎蛋白相关性的实验研究
目的 探讨大鼠龈沟液中牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质涎蛋白(DSP)的表达与实验性牙移动所致牙根吸收的关系.方法 36只健康Wistardd大鼠随机分成3组:对照组、轻力组、重力组.以上颌切牙为支抗,轻力组和重力组分别以0.392、0.98 N力拉右侧上颌第一磨牙向近中移动.加力7 d后,提取龈沟液,制备实验牙及其牙周组织切片,行苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察牙根吸收情况,并通过Western blot检测龈沟液中DSPP、DSP的表达.结果 组织学观察:对照组未见明显的牙根吸收,轻力组未见明显的牙根吸收及破牙骨质细胞,重力组在根尖1/3远中区及根分叉附近出现明显牙根吸收.Western blot结果 显示:对照组中只有DSPP表达,轻力组和重力组中有DSPP和DSP表达.3组大鼠龈沟液中DSPP、DSP蛋白的表达均有统计学差异(P<0.05),重力组中2种蛋白表达高,轻力组次之,对照组低.结论 在正畸所导致的牙根吸收过程中,龈沟液中有DSPP和DSP的表达.
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DSP基因编码区序列的多态性研究
目的:分析中国人群中牙本质涎蛋白基因编码区序列的多态性.方法:采用聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)分析方法,并结合DNA直接测序方法对牙本质涎蛋白基因编码区的核苷酸序列进行分析.结果:在牙本质涎蛋白基因编码区序列中发现了3个单核苷酸多态(cSNP),其中2个为同义cSNP,编码的氨基酸未变,1个为非同义cSNP,编码的氨基酸分别为天冬氨酸和天冬酰氨.结论:中国人群中牙本质涎蛋白基因编码区序列中存在单核苷酸多态.
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DSP、DMP1、CBFA1、BMP2在大鼠牙髓干细胞中的表达
目的:检测DSP、DMP1、CBFA1、BMP2在大鼠牙髓干细胞中的表达,为大鼠牙髓干细胞的生物学功能研究提供基础.方法:采用免疫组织化学染色的方法,对DSP、DMP1、CBFA1、BMP2在大鼠牙髓干细胞中的表达进行检测,然后采用矿化液对大鼠牙髓干细胞进行诱导,并对诱导后细胞进行DSP、DMP1表达的检测.结果:大鼠牙髓干细胞DMP1仅个别细胞阳性表达,DSP少量细胞阳性表达,CBFA1、BMP2为阳性染色.经矿化液诱导后,大鼠牙髓干细胞DSP染色出现部分细胞强阳性,DMP1出现阳性结果.结论:CBFA1、BMP2阳性表达表明大鼠牙髓干细胞具有一定的未成熟性,而经过诱导后出现牙本质特异性DSP的表达,表明大鼠牙髓干细胞可以被诱导向成牙本质细胞方向分化.
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牙本质涎蛋白在氟中毒大鼠牙髓组织和牙本质中的表达和意义
目的:研究氟中毒对大鼠牙髓及牙本质表达DSP的影响.方法:选择20 只Wistar大鼠,随机分为对照组(饮用自来水,水氟浓度0.16 mg/L)和给氟组(水氟浓度100 mg/L).3 个月后处死大鼠,利用HE染色、免疫组化染色观察氟中毒对牙本质结构和DSP表达的影响.结果:100 mg/L组牙本质生长线明显加重,出现大量球间牙本质.DSP蛋白在牙本质、成牙本质细胞、牙髓细胞中均有不同程度的表达,在牙本质层内侧的成牙本质细胞和牙髓细胞的染色强度2 组间无明显区别(P>0.05).在给氟组,强烈的DSP染色持续出现在前期牙本质层和矿化的牙本质层(P<0.05),表现为加重的生长线.结论:DSP在氟中毒组牙本质中表达明显增强,推测氟可能影响DSP蛋白的降解,影响牙本质的正常矿化.
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短期高浓度氟对小鼠磨牙胚中牙本质涎蛋白表达的影响
目的:研究短期高浓度氟对小鼠磨牙成牙本质细胞形态及牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)表达的影响,探讨氟对牙本质发育的作用机制.方法:选择4 d龄的ICR小鼠共32 只,随机分为2 组,每组16 只,各组中实验动物和对照动物各半.实验动物单次腹腔注射剂量分别为10 mg/kg体重和20 mg/kg体重的NaF,对照动物单次腹腔注射等剂量的NaCl,注射量均为10 μl/g, 24 h后处死动物.采用HE染色、免疫组化染色观察高浓度氟对小鼠磨牙不同分化阶段成牙本质细胞形态及DSP的表达,采用SPSS 13.0软件对数据进行分析.结果:实验组分泌期成牙本质细胞形态紊乱,正常的高柱状形态丧失,DSP的表达明显强于对照动物,差异有统计学意义(P<0.01),而成熟期成牙本质细胞未见明显变化.结论:短期高浓度氟能增强分泌期成牙本质细胞中DSP的表达,抑制成牙本质细胞的增殖分化及随后的基质合成与分泌,从而影响牙本质的发育.
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正畸力对幼鼠牙本质中DSP表达的影响
目的:探讨正畸力对牙齿发育过程的牙本质中DSP表达的影响.方法:选取5周龄雄性SD大鼠,建立正畸牙齿移动模型.分别于加力后1、3、7、14、21 d处死动物,取含双侧上颌第一磨牙的上颌标本,制作石蜡切片,进行HE染色和DSP免疫组化染色.结果:牙冠部牙本质小管、前期牙本质、成牙本质细胞和牙根部成牙本质细胞DSP染色阳性.其中,牙尖部位的牙本质小管和前期牙本质呈强阳性染色,14 d时达到高峰,21 d时阳性染色有所减弱;根部成牙本质细胞在实验初期呈弱阳性染色,随时间的延长阳性染色逐渐增强.正常对照组DSP的表达明显弱于实验组.结论:对处于发育晚期的年轻恒牙施加适当的正畸力会促使成牙本质细胞进入活跃状态,牙本质中DSP表达上调,从而在一定程度上加速牙本质的形成及矿化.
