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含氨基化碳纳米管的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏凝胶的制备及性能研究
目的 制备含多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺(MWCNTs-PEI)复合物的壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)温敏凝胶,为双缓释载体的研究提供一定基础.方法 以壳聚糖温敏凝胶为载体,将多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺分散到温敏凝胶中,制备含多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物的壳聚糖温敏凝胶,以胶凝时间为指标,考察β-甘油磷酸钠浓度、pH、温度和多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物质量对壳聚糖温敏凝胶的影响,采用扫描电镜(SEM)、红外光谱(FTIR)等对其表征,并初步考察其体内相容性.结果 流变法测定其胶凝温度大约为37.0℃,在一定范围内,壳聚糖温敏凝胶胶凝时间随β-甘油磷酸钠浓度、pH、温度以及多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物质量的增加而缩短,且在动物体内均可形成凝胶,通过扫描电镜和红外光谱等实验发现,加入多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物后,其不与壳聚糖温敏凝胶发生化学反应,且壳聚糖温敏凝胶孔洞明显变小,结构致密,终导致溶胀率和溶蚀速率的减小.结论 含多壁碳纳米管/聚乙烯亚胺复合物的壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏凝胶具有快速凝胶化和良好的温敏性,可以作为良好的双缓释性载体.
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载高乌甲素可注射壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶的制备与性能研究
目的 制备载高乌甲素(LA)的壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)温敏水凝胶,并研究其凝胶形成的相转变机制和体外释药性能.方法 以生物可降解壳聚糖为载体,以β-甘油磷酸钠为促凝剂制备载高乌甲素可注射壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,采用动态透析法考察其体外释药性能,运用流变学方法研究凝胶形成的相转变机制.结果 优化的制备载高乌甲素可注射壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶的工艺条件为:β-甘油磷酸钠质量浓度560 mg·mL-1、壳聚糖质量浓度22 mg·mL-1、酸溶剂为0.1 mol·L-1冰乙酸、壳聚糖/β-甘油磷酸钠体积比8.75∶1.25,在37℃下其凝胶化时间为338 s.壳聚糖/β-甘油磷酸钠水凝胶对高乌甲素具有缓释作用,其释药行为符合Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型,为溶散释放.流变学研究表明,壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶属于触变体系,具有类似非牛顿流体的剪切变稀的性质,表现出一种“类固体”的凝胶行为.结论 成功制备了具有较好弹性及强度的载高乌甲素可注射壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,且其体外释药具有明显的缓释特征.
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维药溃结安温敏凝胶的制备与其释药性能研究
目的 通过制备快速凝胶化的西帕依溃结安灌肠液(简称溃结安)壳聚糖(CS)/β-甘油磷酸钠(β-GP)温敏凝胶,减少药物的损失,明确其释药能力的变化.方法 以温敏凝胶为载体,以胶凝时间为指标,通过单因素实验考察β-GP质量浓度、pH值、温度对温敏凝胶的影响.采用扫描电镜(SEM)表征凝胶的形状和表面形态,采用红外光谱仪(FTIR)表征凝胶胶凝前后的结构变化.通过载药温敏凝胶体外释放实验,评估凝胶释药能力.结果 溃结安温敏凝胶的胶凝温度为(37.0±4.5)℃,(6.00±0.82) min由液态转变成半固态,对药物的释放速度明显减慢,24h时累积释放率仅为(67.78±0.35)％(n=3),而等量原料药24 h累积释放率为(90.43±0.62)％(n=3),释药行为接近Weibull模型,释药机制为药物扩散与凝胶溶蚀的双重机制.结论 在37.0℃时可实现溃结安溶胶到半固体凝胶的转变,CS/β-GP凝胶体系对溃结安的释放具有缓释性.
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壳聚糖凝胶活性载体与骨髓间充质干细胞的相容性
背景:壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶(Chitosan-disodium β-glycerol phosphate,C/GP)与软骨细胞显示了良好的相容性,因此假设作为组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞也与C/GP凝胶有较好的细胞相容性.目的:观察骨髓间充质干细胞在C/GP凝胶中生长、增殖和成软骨分化,探讨C/GP凝胶与骨髓间充质干细胞的细胞相容性,为软骨组织工程材料寻找新的适宜细胞载体.设计、时间及地点:完全随机对照,细胞组织工程实验,于2005-10/2006-05在解放军第三军医大学西南医院中心实验审完成.材料:成年雌性小型猪6只用于收集骨髓,培养骨髓间充质干细胞.方法:取培养后传至第3代的骨髓间充质干细胞用于实验.在成骨培养条件下检测骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙沉积,在成软骨培养条件下行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测.壳聚糖盐酸溶液与β-甘油磷酸钠溶液混匀后,置37℃孵箱?-10 min即形成壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶.成软骨培养3周,倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞在C/GP凝胶内黏附及成活情况,组织免疫组织化学法分析骨髓间充质干细胞在凝胶内成软骨分化情况,MTT法检测骨髓间充质干细胞种植2,5和8 d后增埴情况.主要观察指标:①猪骨髓间充质干细胞的特征.②骨髓间充质干细胞在C/GP内的黏附和成活.③骨髓间充质干细胞在C/GP内的成软骨分化.④骨髓间充质干细胞在C/GP内的增殖.结果:①猪骨髓间充质干细胞的特征:体外培养的骨髓间充质干细胞旱成纤维细胞样态,在成骨和成软骨诱导条件下可分别向成骨样细胞和软骨细胞分化.②骨髓间充质干细胞在C/GP内的黏附和成活:MTT染色发现,骨髓间充质干细胞植入C/GP凝胶21 d内,细胞黏附于凝胶内并保持90%以上成活.③骨髓间充质干细胞在C/GP内的成软骨分化:体外培养21 d后成软骨诱导的骨髓间充质干细胞在C/GP凝胶内产生大量软骨基质.④骨髓间充质干细胞在C/GP内的增殖:成软骨诱导骨髓间充质干细胞在C/GP凝胶内持续增殖,细胞种植后2,5和8 d,细胞增殖程度差异明显(P<0.05).结论:C/GP凝胶与骨髓间充质干细胞显示了良好的细胞相容性,有利于骨髓间充质干细胞在其内生长、增殖和成软骨分化,有望作为软骨组织工种的细胞载体.
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低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达
背景：以往研究用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度，其他浓度的诱导情况尚无相关研究。目的：观察在低浓度β-甘油磷酸钠条件培养下，牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中，牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况。方法：分离培养人牙髓干细胞，用不同浓度的诱导液诱导牙髓干细胞分别向脂肪细胞，成骨细胞分化，证实其多向分化能力。用5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养牙髓干细胞向牙本质细胞分化，分别在培养第7，14，21，28天提取各组细胞RNA，反转录PCR检测牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况；诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化形成的矿化结节用Alizarin Red S法检测。结果与结论：人牙髓干细胞经过诱导可证实其成功分化为脂肪细胞和成骨细胞；反转录 PCR 结果显示，5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞在培养7，14，21 d，各组细胞牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白的mRNA表达增加，伴随细胞外基质磷酸糖蛋白表达下调；培养至28 d，行矿化结节检测发现牙髓干细胞向成牙本质细胞成功矿化，可见红染的矿化结节。结果证实，5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养的牙髓干细胞可成功分化为成牙本质细胞，并下调细胞外基质磷酸糖蛋白mRNA的表达，同时上调牙本质基质蛋白1及牙本质涎蛋白mRNA的表达。
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大鼠骨髓基质细胞在温敏型壳聚糖水凝胶中的生长
目的:观察体外分离培养的骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)与温敏型水凝胶壳聚糖,甘油磷酸钠(chitosan/glycerophosphate,C/GP)的生物相容性.方法:实验于2006-03/12在白求恩国际和平医院实验室完成.SD大鼠MSCs经过体外培养传代后,与制备温敏型水凝胶C/GP在培养板内共培养7 d,同时设立细胞对照组(仅加入细胞培养基).采用形态学观察、MTT法检测MSCs在C/GP的生长情况,并绘制生长曲线.结果:①MSCs接种于C/GP复合物24 h后见细胞成球状,未见明显梭形及多角形细胞,48 h内生长速度较慢,72 h后可见梭形、多角形细胞,细胞数量明显增多.②绘制MSCs生长曲线为"S"形,第1个24h为细胞潜伏适应期,第2-3个24h为对数生长期,4 d后细胞增殖减慢,5 d后细胞基本停止生长.细胞对照组的细胞潜伏适应期为第1～2个24 h,对数生长期推后至3-5个24 h,1周后细胞基本停止生长.结论:MSCs在C/GP凝胶中可良好存活、增殖,MSCs与C/GP凝胶有良好的生物相容性.
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氢溴酸东莨菪碱温敏型鼻用原位凝胶的制备
目的 制备氢溴酸东莨菪碱的温敏型鼻用原位凝胶.方法 用不同质量浓度和配比的壳聚糖、β-甘油磷酸钠制备不同pH的原位凝胶,并测定其凝胶化时间、黏度变化情况与载药凝胶的累积释放度.结果 质量浓度为2％的壳聚糖和56％的β-甘油磷酸钠体积比为6∶1,pH7.1时原位凝胶黏度达到5Pa·s,初始凝胶温度为34℃,随着温度的升高、壳聚糖质量浓度的增加、β-甘油磷酸钠含量的增加、pH升高(由6.5升至7.2),凝胶化时间减少;以氢溴酸东莨菪碱为模型药物,载药凝胶中药物10 h累积释放度为71％,释放曲线符合一级动力学方程.结论 壳聚糖/β-甘油磷酸钠制备的氢溴酸东莨菪碱温敏型原位凝胶对药物具有缓释作用,适合制成鼻用制剂.
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壳聚糖温敏凝胶引导组织再生膜的制备及其细胞生物相容性
目的 制备壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)膜,通过体外细胞培养评价新型引导组织再生膜的细胞生物相容性.方法 利用CS/β-GP体系的温敏相转变特性,通过分子自组装技术合成温敏凝胶膜,采用红外光谱分析、扫描电镜、拉伸强度实验进行结构和力学测试.通过MTT比色法对体外培养的小鼠成纤维细胞L929生长及增殖情况进行初步评价,共分3组进行对比研究:实验A组(2%CS+0.5 gβ-GP)、实验B组(2%CS+1.0 gβ-GP)及空白对照组.结果 红外光谱分析提示,壳聚糖与β-甘油磷酸钠分子间存在静电作用和化学键结合,形成新的化合物;扫描电镜观察,壳聚糖/β-甘油磷酸钠膜具有多孔的表面结构和内部结构;L929细胞体外培养第3、4、5天,实验组与空白对照组吸光度(A)值组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏凝胶具有良好的成膜性,能促进成纤维细胞的体外增殖,是一种有应用前景的新型引导组织再生膜材料.
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miR-206对高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制
目的：观察微小 RNA-206（miR-206）对β-甘油磷酸钠（β-GP）诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响，并探讨其机制。方法取原代培养大鼠主动脉 VSMCs 并进行细胞鉴定。将 VSMCs 随机分为5组：空白对照组、模拟物阴性对照组、miR-206模拟物组、抑制物阴性对照组、miR-206抑制物组，用相应引物进行转染。转染后48 h，各组给予β-GP 10 mmol／L 诱导 VSMCs 钙化。诱导4 d，茜素红染色镜下观察各组钙化情况，采用微量酶标法检测细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，采用免疫荧光法检测细胞缝隙连接蛋白43（Cx-43）表达。结果VSMCs 转染后48 h，经β-GP 诱导4 d，与阴性对照组比较，miR-206模拟物组钙化结节减少，miR-206抑制物组钙化结节增多；与阴性对照组比较，miR-206模拟物组 ALP 活性及 Cx43表达降低（P 均＜0．05），miR-206抑制物组 ALP 活性及Cx43表达升高（P 均＜0．05）。结论miR-206可能通过调控 Cx43表达抑制β-GP 诱导的大鼠 VSMCs 钙化。
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载氯诺昔康壳聚糖关节腔注射用温敏凝胶的制备及体外释药性观察
目的 制备关节腔注射用载氯诺昔康(Lnxc)壳聚糖温敏凝胶,观察其理化性质及体外释药性.方法 以壳聚糖、β-甘油磷酸钠(β-GP)为材料制备载Lnxc湿敏凝胶,以胶凝温度、时间、通针性为评价指标,优化处方工艺;采用椎板法观察凝胶的流变学性质,采用离心试验、温度试验观察凝胶的稳定性,采用动态膜透析法观察载Lnxc温敏凝胶和Lnxc溶液的体外释药特性.结果 载Lnxc壳聚糖温敏凝胶的佳处方为Lnxc 2 mg、3％壳聚糖、60％ β-GP、pH 7.2,所制备的温敏凝胶属于非牛顿流体,离心后无分层现象,4℃和25℃条件下呈流动状,37℃发生相变形成凝胶.Lnxc溶液8h药物累积释放率86.70％,载Lnxc温敏凝胶72 h药物累积释放率86.41％,释药规律符合Higuchi方程.结论 成功制备载Lnxc壳聚糖关节腔用温敏凝胶,其具有理想的胶凝温度和较好的缓释效果.
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接枝Nogo-A抗体的温敏型壳聚糖水凝胶的制备及其与大鼠骨髓间充质干细胞生物相容性的研究
目的 制备接枝Nogo-A受体(NgR)抗体的温敏型壳聚糖(C/GP)水凝胶,观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种于该水凝胶上的生长及两者间生物相容性.方法 β-甘油磷酸钠(GP)与壳聚糖(C)按1∶3体积比制备C/GP水凝胶,氧化接枝NgR抗体,制备C/GP-NgR抗体水凝胶,观察理化性状及成胶,检测NgR抗体水平.分离、培养BMSCs,流式细胞仪检测CD34、CD45、CD29、CD90的表达;第3代BMSCs分别接种于C/GP水凝胶(A组)及C/GP-NgR抗体水凝胶(B组)上培养,水溶性四氮唑(WST-1)法检测BMSCs细胞增殖效应,吖啶橙(AO)染色及荧光倒置相差显微镜观察BMSCs生长及活性.结果 成功制备C/GP-NgR抗体水凝胶,具有温敏性,NgR抗体水平较对照组增高(P＜0.05),室温下C/GP溶液pH值平均为7.2.CD34、CD45、CD29、CD90阳性细胞比率分别为0.79％、6.80％、98.90％、99.90％.AO染色细胞核呈绿色,未见橘红色固缩状细胞.两组细胞培养1 ～7d呈时效性增殖,3～5d生长快;培养5d,B组细胞增殖明显.结论 BMSCs接种于C/GP-NgR抗体水凝胶上培养,细胞生长增殖良好、活性正常,两者间具有良好的生物组织相容性.
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异烟肼温敏性水凝胶的制备及溶出度试验
目的:制备可注射的异烟肼温敏性水凝胶并测定其溶出度.方法:以壳聚糖、β-甘油磷酸钠为基质制备异烟肼凝胶,采用紫外分光光度法测定异烟肼的含量,并考察样品体外释药行为.结果:壳聚糖/β-甘油磷酸钠体系在温度37℃时,20 min可形成凝胶.异烟肼在前1 h快速释放50%,后缓慢平稳释放.结论:本凝胶制备方法简单,质量可控,具有缓释性.
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人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究
目的 拟建立一套较为简便、有效和实用的人脐血间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,探讨其向成骨细胞分化的可行性.方法 由人脐静脉血获得MSCs,纯化培养后用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导,通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色检测诱导后细胞.结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞,间充质样细胞为类似成纤维细胞样的细胞形态.诱导培养的细胞碱性磷酸酶染色呈阳性.结论 人脐血MSCs经合理的体外诱导培养后,可以分化为成骨细胞.
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壳聚糖基温敏凝胶膜体内引导骨再生性能研究
目的:观察壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP,chitosan/β-glycerophosphate salt)温敏凝胶复合膜及其负载釉基质蛋白(EMPs,enamel matrix proteins)体内引导骨再生的生物特性.方法:体外合成CS/β-GP温敏凝胶复合膜并负载EMPs.10只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为A、B两组,分别为实验1个月和2个月组.大鼠颅骨中线两侧制备直径5mm的极量骨缺损(critical size defect,CSD);左侧为实验侧,覆盖CS/β-GP(1.0g)复合膜负载EMPs,右侧覆盖单纯CS/β-GP复合膜为对照侧.通过大体观察、X线新生骨密度测量、HE染色等方法比较两组复合膜修复骨缺损的情况.结果:测量1个月、2个月双侧骨密度百分比,差异具有统计学意义(P<0.05);HE染色发现,术后1个月双侧均有少量新骨生成;术后2个月,实验侧内的新骨生成增加且更致密、 趋于成熟.结论:该种类CS/β-GP复合膜具有引导骨再生的特性,负载生物活性因子后能明显加速骨愈合.
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新型壳聚糖基引导骨再生膜的蛋白缓释性能研究
目的：制备负载牛血清白蛋白的壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)可吸收性膜，探讨其缓释蛋白的性能。方法：利用CS/β-GP体系的温敏相转变特性，同时向其中添加蛋白制成新型生物膜。进行膜厚度及拉伸强度等力学性能测试。利用BCA蛋白浓度试剂盒（加强型）检测不同时点的蛋白浓度，绘制膜的蛋白缓释曲线。结果：利用SPSS16.0统计分析软件进行分析，负载蛋白后复合膜的理化性能均未发生明显变化（P>0.05）。不同浓度的复合膜可缓慢释放蛋白12天以上，并且随着β-GP浓度的升高，蛋白缓释总量增大。结论：新型壳聚糖温敏凝胶膜可以作为蛋白缓释的载体，是在引导骨再生领域具有应用潜力的生物膜材料。
