首页 > 文献资料
-
改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞
背景:骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如伺能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一.目的:应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况.方法:切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5～1.0 cm~2:①常规方法:以0.25%胰蛋白酶在37℃消化30 min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37℃消化30 min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2 h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养.②改良方法:将Ⅰ型胶原酶消化时间由30 min改为1 h.碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞.将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况.结果与结论:培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性.常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12 d左右.在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌.两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义.提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响.
-
优化酶消化法体外培养及鉴定SD大鼠的成骨细胞
背景:体外成骨细胞的培养技术已经有了很大的发展.但是,在培养过程中,如果胰蛋白酶的消化时间过长,成骨细胞膜便易受到损伤;同时,传统的培养方法存在所获得的成骨细胞数量少、纯度不高等不足.因此,有必要探求一种新的体外培养成骨细胞的方法.目的:优化成骨细胞在体外条件下的培养方法并对其进行鉴定.设计:观察性实验.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/05在暨南大学附属第一医院骨科完成.选用出生24h的SD大鼠8只,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验用Ⅱ型胶原酶由美国Sigma公司分装,胰蛋白酶为Sigma公司产品,碱性磷酸酶试剂盒由南京建成生物制品公司生产,SABC-1021试剂盒由武汉博士德公司进口分装.方法:挑选24h之内的新生SD乳鼠麻醉后处死,无菌条件下取出颅骨,剔除附着的结缔组织及骨膜,D-Hank's液冲洗3次.不强调对颅骨内、外膜,骨缝连接处等附着的结缔组织及颅顶的透明软骨结节等进行反复多次的剔除,避免操作时间过长影响细胞的存活率.结合0.1%Ⅱ型胶原酶来消化SD乳鼠颅骨,减少并严格控制胰蛋白酶的消化时间.组织块经0.25%胰蛋白酶消化20 min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60 min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化.主要观察指标:应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜观察成骨细胞形态特点.采用碱件磷酸酶Gomori钙钴法染色、钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色方法进行鉴定成骨细胞生物学特性.结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相连接,细胞核较幼稚,细胞器丰富,具有典型的成骨细胞形态特征.体外培养的成骨细胞可分泌碱性磷酸酶,改良钙钴法染色阳性率可达90%,并可形成钙结节,Ⅰ型胶原染色阳性,具有成骨细胞的生物学功能.结论:实验用优化后的酶消化法分离、培养的SD大鼠成骨细胞具有典型的成骨细胞生物学特征.
-
改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞
背景:乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量.目的:比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性.方法:取无龋滞留乳切牙12颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34和CD45的表达.细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能.结果与结论:两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义(P＜0.05)；牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达.然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义(P＞0.05).说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法.
-
幼兔颅盖骨成骨细胞的分离培养及鉴定
背景:成骨细胞的提取分离尚无公认的高效简便的实验方法.目的:探讨用改良酶消化法体外分离、培养并鉴定新西兰幼兔颅盖骨成骨细胞的实验方法.方法:实验利用成纤维细胞胰酶消化时脱壁早,终止消化后贴壁快的特点,采用改良酶消化法分离3 d龄新西兰幼兔颅盖骨成骨细胞并用差速贴壁法纯化培养.倒置显微镜每日观察细胞形态及其生长状况,采用MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,测定碱性磷酸酶含量,免疫组织化学染色法检测Ι型胶原、骨钙素,Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,RUNX2)表达,茜素红染色矿化结节等对成骨细胞及其生物化学特性进行鉴定.结果与结论:①成功分离提取并差速贴壁法纯化培养成骨细胞;②分离培养的成骨细胞贴壁生长,显示正常的成骨细胞形态和生长特征;细胞增殖能力良好;③细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、RUNX2染色均阳性,常规培养21 d茜素红染色形成矿化结节;④结果证实,改良酶消化法培养出的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征,成分单一,存活率高.
-
改良分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞及诱导分化鉴定*
目的：采用改良分次酶消化法体外分离培养家兔肌腱干细胞，观察其生物学特性，并进行诱导分化及鉴定。方法无菌条件下取出家兔髌腱组织，分别运用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀释接种法进行分离、培养、传代，用倒置相差显微镜观察细胞形态特征并绘制两种方法的生长曲线，通过流式细胞鉴定仪检测肌腱干细胞表面抗原标志物的表达，取P3- P4代肌腱干细胞向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果改良的分次酶消化法较酶消化后低密度稀释接种法细胞增殖速度加快，形态均一，杂质细胞少。分离出的肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44呈阳性，而CD34、CD14呈阴性，证实之前分离的细胞为肌腱干细胞。鉴定出肌腱干细胞具有向成骨细胞和成软骨细胞分化能力。结论采用改良的分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞简单易行，肌腱干细胞生长及传代速度可观，活性良好，纯度较高。另外，肌腱干细胞的成功分离培养，也为肌腱相关疾病的研究开辟了一条新途径。
