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尼古丁对大鼠髌腱肌腱干细胞生物学特性影响的实验研究
目的:探讨体外尼古丁对大鼠髌腱肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的细胞活力、细胞早期凋亡以及肌腱相关基因表达的影响,揭示吸烟导致肌腱病变以及损伤肌腱延迟愈合的潜在细胞学发病机制.方法:无菌条件下取8周龄SD大鼠的髌腱,Ⅰ型胶原酶消化分离获得单个有核细胞,以适密度(50个/cm2)进行接种,细胞呈克隆样生长,获得原代TDSCs.基础培养细胞至第3代,将其分为两组,实验组用不同浓度的尼古丁培养基(10-7 M,10-6 M,10-5 M,10-4 M和10-2 M)干预,对照组继续采用基础培养基(0M)培养.处理6h、24 h、48 h和72 h后分别应用四唑盐(MTT)比色法检测尼古丁对TDSCs体外存活的影响,72h后应用Annexin V-FITC/PI双染法检测尼古丁对TDSCs体外早期凋亡的影响,实时荧光定量PCR(Realtime PCR)检测肌腱相关基因Col1a1和Scx的表达.结果:与对照组相比,实验组不同浓度的尼古丁干预下,TDSCs的细胞活力呈下降趋势,呈时间依赖性和浓度依赖性,浓度高于10-4M时作用显著,差异具有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测TDSCs早期凋亡(Annexin V+/PI-)的数量随着尼古丁浓度的增加而增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).同时,Realtime PCR检测结果显示:与对照组相比,实验组中Col1a1和Scx的mRNA表达水平均降低,浓度高于10-5 M时作用显著,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:体外尼古丁可抑制大鼠髌腱TDSCs的细胞活力,导致TDSCs早期凋亡,同时抑制TDSCs中成肌腱分化转录、细胞外基质合成相关基因的表达.这可能是吸烟导致肌腱病变以及损伤肌腱延迟愈合的潜在细胞学发病机制.
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肌腱干细胞特性相关研究新进展
肌腱干细胞从肌腱中分离获得,是具有多向分化潜能的间充质类干细胞,其在肌腱修复中发挥非常重要的作用.肌腱干细胞的发现为慢性腱病的发病机制研究提供了新方向,也为多种疾病的治疗提供了新思路.然而其在体内的分布、作用、调控机制等仍存在未知和争议.本文围绕肌腱干细胞的来源、微环境、调控因素进行综述,阐述其可能的生物特性,并探讨潜在的研究方向.
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载氧化铁PLGA微粒标记肌腱干细胞的磁共振/光声示踪的实验研究
目的 探讨载氧化铁聚乳酸羟基乙酸微粒(PLGA/IO MPs)标记肌腱干细胞(TSCs)的效率及磁共振(MR)/光声(PA)成像双模态体内示踪 TSCs的可行性.方法 利用前期制备的PLGA/IO MPs与前期实验分离培养的TSCs共同孵育以标记 TSCs ;于标记后3 、 7 、 14 、 21和28 d对标记TSCs分别进行MR/PA成像及普鲁士蓝染色,应用电感耦合离子体原子发射光谱法(ICP-OES)测量标记TSCs细胞内Fe浓度.使用外科手术方式建立SD大鼠右侧肩袖损伤模型并移植标记 TSCs ,移植后第3 、 7 、 14 、 21和28 d对大鼠肩袖进行MR/PA双模态成像观察标记TSCs .结果 随着标记时间的延长,标记TSCs的MR和PA信号逐渐减弱,细胞内Fe含量逐渐减低,至标记后第28 d细胞内Fe含量与未标记TSCs差异无统计学意义(1 .45 pg Fe/cell对1 .17 pg Fe/cell ,P ＞0 .05).大鼠肩袖损伤模型中,MR/PA成像能有效示踪标记TSCs分别长达21 d和7 d .结论 PLGA/IO MPs能有效标记TSCs长达21 d ,双模态MR/PA成像在大鼠肩袖损伤模型中能有效示踪标记TSCs .
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载氧化铁聚乳糖-羟基乙酸微粒标记大鼠肌腱干细胞的体外实验研究
目的 制备载氧化铁(IO)/PLGA 微粒(PLGA/IO M Ps),探讨其标记大鼠肌腱干细胞(TSCs)以及体外超声(US)/光声(PA)/磁共振(MRI)多模态成像的可行性.方法 使用双乳化法制备PLGA/IO MPs,并进行理化性质检测及US/PA/MRI成像.应用PLGA/IO MPs标记 TSCs,并用透射电镜(TEM)及普鲁士蓝染色观察标记效果,然后对标记后 TSCs进行体外 US/PA/MRI成像.结果 制备的PLGA/IO MPs粒径约(801.5 ± 165.6)nm,Zeta电位约(-6.36 ± 3.36)mV[含多聚左旋赖氨酸约(3.16 ± 3.69)mV].PLGA/IO MPs具有体外US/PA/MRI多模态显像的能力,标记TSCs后,PLGA/IO MPs位于TSCs细胞质内,且标记的 TSCs能同时进行 US、PA和MRI成像显示出相应的影像学信号.结论 PLGA/IO MP能够对TSCs进行有效标记,并成功行体外 US/PA/MRI多模态成像,为活体内移植后TSCs的无创、多模态示踪奠定了基础.
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机械因素对组织工程干细胞增殖和分化的影响
背景：随着组织工程技术的发展和再生肌腱研究的深入，将解决传统肌腱移植所引起的诸多问题。
目的：依据肌腱自身性质、干细胞的优缺点、机械力学系统的特点以及相应的力学系统对种子细胞的影响进行评价与展望。
方法：检索中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识资源总库(CNKI)系列数据库、中文科技期刊数据库、PubMed 数据库2005年1月至2015年12月收录的肌腱组织工程相关综述和论文报告，检索词为组织工程(tissue engineering)，肌腱(tendon)，肌腱干细胞(tendon stem cel )，力学刺激(mechanical stimulation)，种子细胞(seeding cells)，终纳入63篇文献进行分析。
结果与结论：①各种干细胞及相应的力学系统在组织工程的应用中各有优势和不足，研究者可根据研究需要加以选择；②肌腱干细胞在再生肌腱领域里应用有着广阔的前景，通过合适、精确、温和的机械力学刺激将肌腱干细胞培养成为满足需要的肌腱组织，将为医生和患者改善肌腱损伤后临床愈合效果提供另一种选择。 -
组织工程肌腱离临床应用有多远：如何解决力学性能、组织融合性及后期退化
背景：组织工程肌腱已经被应用到修复破坏的肌腱组织，作为肌腱损伤修复过程中重要的方法，已成为研究的热点。目的：通过对种子细胞的种类及优缺点、支架材料的设计及优缺点以及诱导肌腱形成的因素进行阐述，促进每个关节点的优化，有利于组织工程肌腱的成熟构建。方法：检索中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识资源总库(CNKI)系列数据库、中文科技期刊数据库、PubMed数据库2000年1月至2015年1月收录的肌腱组织工程相关综述和论文报告，检索词为组织工程Tissue Engineering)；肌腱(tendon)；肌腱缺损，并分析其种子细胞、支架及诱导途径的研究进展。结果与结论：总结近年来组织工程肌腱在肌腱损伤中的研究工作，讨论包括种子细胞、支架、诱导因素在内的研究方法。肌腱干细胞作为种子细胞是目前组织工程肌腱研究过程中的首选，不仅具有与同种或者同体肌腱的同源性，而且分化增殖能力较强。但目前对于肌腱干细胞的获取及增殖培养无系统的方案；目前组织工程肌腱的支架材料及支架设计不能达到临床上对于组织工程肌腱力学的要求，形成的肌腱组织力学性能差，与宿主组织融合差，后期容易退化甚至功能性废用等原因；诱导因素作为后的关键因素，对于其诱导因子的选取和利用是调控肌腱组织发育的必备条件。但诱导因子的种类与利用途径之间的联系及相互关系尚不完全明确，也有待进一步发展。
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慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力
背景：慢性腱病是一种常见的肌腱退行性病变，好发于运动员以及肌腱过度劳损的人群。由于慢性腱病的发病机制尚未阐明，临床上还缺乏有效的治疗手段。
目的：体外研究比较慢性腱病大鼠和正常大鼠来源肌腱干细胞成脂、成肌腱分化能力。
方法：从慢性腱病大鼠以及正常大鼠髌腱中分离培养原代肌腱干细胞，传代培养至第3代，体外观察细胞形态学变化。将两种来源肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合，分为2组，成脂诱导组用成脂诱导培养基培养，对照组用基础培养基培养。成脂诱导分化21 d后，将两种来源肌腱干细胞的成脂诱导组和对照组分别行油红O染色定量分析。实时荧光定量PCR检测各组细胞成脂性基因C/EBPα和PPARγ2的mRNA的表达。将两种来源的肌腱干细胞体外单层培养至70%-80%融合时，行实时荧光定量PCR检测慢性腱病来源肌腱干细胞以及正常肌腱干细胞成肌腱相关基因Col1a1，Scx，Tnmd和Dcn的mRNA的表达。
结果与结论：肌腱干细胞体外培养至第3代时，正常肌腱来源的肌腱干细胞保持细长纺锤形的典型的干细胞形态，而慢性腱病来源的肌腱干细胞虽然形态发生改变，但仍保持纺锤形形态。肌腱干细胞(P3)体外成脂诱导分化21 d后，慢性腱病来源的肌腱干细胞胞体变大、变圆，可见大量油红O染色阳性的细胞，油红O染色阳性率显著高于正常大鼠(P=0.004)。实时荧光定量PCR结果显示，慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的成脂性基因(C/EBPα和PPARγ2)mRNA的表达均显著高于正常大鼠(P=0.004)，肌腱特异性基因Col1a1，Scx， Tnmd以及Dcn mRNA表达量均明显低于正常大鼠(P =0.009)。说明与正常大鼠来源的肌腱干细胞相比，慢性腱病来源的肌腱干细胞体外成肌腱分化的能力减弱，而成脂分化的能力增强，此结果为进一步揭示慢性腱病发病机制提供了细胞生物学依据。 -
骨形态发生蛋白2诱导慢性腱病大鼠肌腱干细胞体外成骨、成软骨分化
背景：目前临床对于慢性腱病缺乏有效的治疗手段，原因在于其发病机制至今尚未阐明。
目的：研究体外骨形态发生蛋白2对胶原酶诱导的大鼠慢性腱病模型髌腱来源肌腱干细胞的成骨、成软骨分化的作用。
方法：从大鼠慢性腱病模型的髌腱中分离培养出原代肌腱干细胞，传代培养至第3代细胞，行成骨、成脂、成软骨诱导分化鉴定其干细胞的特性。将肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合，用重组人骨形态发生蛋白2干预。7 d后分别行茜素红染色，并行茜素红染色定量分析。将肌腱干细胞体外三维微球培养后分为2组，诱导组用重组人骨形态发生蛋白2干预，对照组不进行干预。21 d后三维微球行苏木精-伊红染色，阿利辛蓝染色以及Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。
结果与结论：慢性腱病大鼠来源原代肌腱干细胞体外培养呈克隆样集落生长，传代后细胞主要表现为多突的纺锤形和星形的扁平细胞，具有成纤维细胞样的特征。肌腱干细胞(P3)成脂诱导10 d，油红O染色阳性；成骨诱导7 d，茜素红染色阳性；成软骨诱导14 d，苏木精-伊红染色阳性可见软骨样细胞，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。单层培养的肌腱干细胞用重组人骨形态发生蛋白2诱导7 d茜素红染色阳性，对照组为阴性，茜素红染色定量检测显示差异有显著性意义。重组人骨形态发生蛋白2诱导肌腱干细胞21 d，苏木精-伊红染色可见软骨样细胞形成、阿利辛蓝染色可见细胞内糖胺多糖沉积、Sox9和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。可见体外重组人骨形态发生蛋白2可以诱导慢性腱病来源的肌腱干细胞成骨、成软骨分化。这为进一步研究慢性腱病的发病机制提供了细胞生物学依据。 -
富血小板血浆与肌腱干细胞共混物干预跟腱病模型兔肌腱组织形态及金属蛋白酶1的表达
背景:富血小板血浆针对组织重建修复的研究及应用一直是医学及生物工程学的研究热点.目的:观察富血小板血浆与肌腱干细胞共混物对肌腱病兔肌腱组织形态及金属蛋白酶1表达的影响.方法:将40只新西兰大白兔随机分为2组,模型组(n=32)在距左跟骨附着点约2 cm处注射前列腺素E2,1次/周,共4周,建立肌腱病动物模型;空白对照组(n=8)相同部位注射等量的生理盐水.4周后,将模型组随机分为4组,联合组于跟腱局部注射自体富血小板血浆与自体肌腱干细胞混合物,干细胞组注射自体肌腱干细胞,富血小板血浆组注射自体富血小板血浆,模型对照组注射等量的生理盐水,每3周1次,注射2次.注射6周后取跟腱组织标本,进行组织学检查及金属蛋白酶1检测.结果与结论:①苏木精-伊红染色:联合组纤维组织排列有序,纤维完整;干细胞组纤维组织有少许断裂,纤维排列较为整齐;富血小板血浆组纤维断裂明显,纤维结构松散;模型对照组肌腱纤维形态差,未见完整纤维结构,炎性细胞浸润明显;②Masson染色:联合组纤维组织有轻微波浪状改变,但纤维连续;干细胞组纤维组织轻微紊乱,组织无明显断裂,炎性细胞浸润明显;富血小板血浆组纤维组织断裂明显,胶原纤维明显减少,炎性细胞浸润明显;模型对照组已无明显纤维排列结构,炎性细胞浸润明显;③金属蛋白酶1水平:干细胞组、富血小板血浆组、模型对照组金属蛋白酶1水平高于空白对照组(P＜0.05),联合组金属蛋白酶1水平与空白对照组接近(P＞0.05);④结果表明:富血小板血浆与肌腱干细胞共混物可通过抑制肌腱细胞基质及胶原降解的恶性循环、下调肌腱细胞中金属蛋白酶1表达,延缓肌腱病炎性反应及退行性改变.
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糖尿病大鼠髌腱来源肌腱干细胞体外成脂分化潜能的实验研究
目的:观察糖尿病大鼠髌腱来源的肌腱干细胞( TDSCs)体外成脂分化的潜能,探讨糖尿病对TDSCs成脂分化潜能的影响.方法:采用链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,提取大鼠髌腱TDSCs;观察细胞形态,并在体外诱导其成脂分化,通过油红O染色和检测成脂分化相关基因( C/EBP和PPARγ2)的mRNA表达,比较糖尿病组与对照组TDSCs成脂分化潜能的差异.结果:造模后糖尿病组血糖水平显著高于对照组,并持续 高于250 mg· dl -1.对照组TDSCs( hTDSCs)形态在镜下表现为均一的细长纺锤型,而糖尿病组TDSCs( dTD-SCs)表现为多突的纺锤型.成脂分化诱导9 d后,经油红O染色,对照组细胞内可见大量的脂滴形成,而糖尿病组细胞内仅有少量的脂滴形成,dTDSCs油红O染色阳性率显著低于对照组. dTDSCs C/EBP、PPARγ2的mRNA水平也显著低于hTDSCs.结论:糖尿病TDSCs体外成脂分化能力较hTDSCs显著降低,此结果为进一步揭示糖尿病肌腱病变过程中,持续体内高糖环境对TDSCs成脂分化功能影响的潜在分子机制提供了细胞生物学依据.
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慢性腱病治疗的新策略:调控肌腱干细胞成肌腱分化促进肌腱愈合
1 前言随着我国国民生活质量的提高以及人们对体育锻炼的日益重视,越来越多的人参与到体育运动中来.与此同时,由于不恰当的运动方式、意外事故的发生以及人口的逐步老龄化,运动性损伤的发病率也逐年升高.运动过程中,由于肌腱持续不断的承受大量的机械负荷,从而导致组织病理上的变化,终发展成慢性腱病[1].慢性腱病的发病率很高[2],有统计结果显示:每年至少有3 000万的肌腱受损病人[3],肌腱疾病几乎占美国所有职业性损伤的一半[4].
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人髌腱干细胞的分离培养与鉴定
[目的]研究从人的髌腱组织中分离出肌腱干细胞,并进行体外培养扩增鉴定.[方法]通过胶原酶消化法和低密度接种培养法从人的髌腱组织中分离出肌腱干细胞.通过三期分化鉴定,分离出的肌腱干细胞具有向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞方向分化的能力.通过流式细胞术,鉴定分离出细胞的干细胞表面标记因子的表达.通过免疫组织化学检测其肌腱细胞和软骨细胞相关蛋白的表达.[结果]从人的髌腱组织中成功分离出肌腱干细胞,大约有1.2％ ～1.4％分离出的细胞形成单细胞克隆.分离出的细胞表达CD44+,CD105+,CD29+,CD45-,和CD14-,并具有向不同细胞分化的能力;另外,肌腱干细胞不仅表达肌腱细胞相关蛋白,如Ⅰ型胶原和tenascin C,也同时会表达软骨细胞相关的蛋白,如Sox 9和Ⅱ型胶原,但其并不表达糖氨多糖.[结论]成功分离鉴定人髌腱干细胞,虽然与间充质干细胞有相同的干细胞特性,是不同于其他间充质干细胞的一种特殊的间充质干细胞.肌腱干细胞的成功分离鉴定有利于以后干细胞相关的肌腱组织修复的研究,并有助于更好的理解肌腱干细胞在肌腱相关疾病和修复的作用.
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大鼠皮肤成纤维细胞分泌的细胞外基质对肌腱干细胞特性的影响
[目的]探讨皮肤成纤维细胞分泌的细胞外基质(ECM)对肌腱干细胞增殖及腱向分化的影响.[方法]选取雄性SD大鼠10只,体重285 ～310 g,无菌切取皮肤及髌腱组织,进行皮肤成纤维细胞及肌腱干细胞的分离和培养.制备成纤维细胞分泌的ECM包被的培养皿,以空白培养皿为参照,在肌腱干细胞接种于培养皿后,计算细胞倍增时间,利用细胞免疫荧光检测干细胞表面标志.利用RT-PCR检测腱向分化相关基因的表达.[结果]成纤维细胞分泌的ECM显著缩短了肌腱干细胞的倍增时间(P＜0.01).成纤维细胞分泌的ECM能明显诱导肌腱干细胞分化,同时其可以有效促进腱向分化相关基因的表达.[结论]皮肤成纤维细胞分泌的ECM可以有效促进肌腱干细胞增殖及腱向分化,这为优化肌腱干细胞的实验研究提供了有利的理论依据,为肌腱损伤后优质愈合提供了新的思路方法.
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改良分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞及诱导分化鉴定*
目的：采用改良分次酶消化法体外分离培养家兔肌腱干细胞，观察其生物学特性，并进行诱导分化及鉴定。方法无菌条件下取出家兔髌腱组织，分别运用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀释接种法进行分离、培养、传代，用倒置相差显微镜观察细胞形态特征并绘制两种方法的生长曲线，通过流式细胞鉴定仪检测肌腱干细胞表面抗原标志物的表达，取P3- P4代肌腱干细胞向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果改良的分次酶消化法较酶消化后低密度稀释接种法细胞增殖速度加快，形态均一，杂质细胞少。分离出的肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44呈阳性，而CD34、CD14呈阴性，证实之前分离的细胞为肌腱干细胞。鉴定出肌腱干细胞具有向成骨细胞和成软骨细胞分化能力。结论采用改良的分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞简单易行，肌腱干细胞生长及传代速度可观，活性良好，纯度较高。另外，肌腱干细胞的成功分离培养，也为肌腱相关疾病的研究开辟了一条新途径。
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体外细胞单轴循环牵伸载荷模型建立的实验研究
目的 研制一种体外细胞单轴循环牵伸模型.方法 用硅树脂材料制备带微沟槽培养皿,运用有限元软件ABAQUS分析培养皿应变分布.将肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)在培养皿中培养,观察TSCs贴壁生长情况.可编程控制器(programmable logic controller,PLC)控制牵伸模型机械运行部分对培养皿周期性牵伸.按不同牵伸频率(0.5、1.0、2.0、3.0 Hz)及应变(4％、8％、16％、20％)分为16组连续牵伸24h,检测培养皿实际运行次数及位移量变化;倒置显微镜观察TSCs有无脱落及漂浮;在牵伸时间为8、12 h(频率1 Hz、应变8％)时,用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞骨架中F-actin形态变化.结果 硅树脂培养皿应变分布较均匀,培养皿底膜有效应变范围约占总面积的91％.TSCs在培养皿中培养10 h时,全部贴壁且沿微沟槽方向生长.在不同牵伸条件下牵伸模型运行稳定,硅树脂培养皿实际运行频率、应变位移距离和设定频率及理论应变位移距离比较差异无统计学意义(P＞0.05);TSCs无明显脱落及漂浮;牵伸组F-actin束变细,部分发生断裂,红色荧光(F-actin)染色减弱且分布不均匀.结论 体外细胞单轴循环牵伸载荷模型建模成功.该模型操作简便、参数设计范围宽,可模拟不同条件进行体外贴壁细胞生物力学载荷实验研究.
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大鼠跟腱来源肌腱干细胞的分离培养及鉴定
目的 从大鼠跟腱标本中分离培养肌腱干细胞(tendon stem/progenitor cells,TSCs)并加以鉴定.方法 大鼠跟腱经消化后,获取的有核细胞按不同密度在37 ℃,5％ CO2条件下培养,原代为P0代,P1～P3代用于实验研究.观察其克隆形成和增殖能力,用流式细胞仪和免疫组化染色方法对其干细胞标志物予以鉴定,以不同的全成分诱导分化液诱导,观察其多向分化潜能.结果 大鼠跟腱来源肌腱干细胞具有克隆生长特性,表面标记物表达为CD44h(+)、CD90(+)、CD34(-)、CD106(-),免疫荧光染色显示SSEA4、Nucleostemin及I型胶原蛋白表达均为阳性.经诱导后能够向成骨、成脂肪、成软骨多向分化.结论 大鼠跟腱来源肌腱干细胞具有干细胞特性,不同条件下可能向不同方向分化.
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肌腱干细胞在骨肌腱接点纤维软骨带重建中的作用机制研究进展
目的 对肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)在骨肌腱接点(bone-tendon junction,BTJ)纤维软骨带重建中的作用机制进行综述.方法 广泛查阅国内外有关TDSCs促进BTJ纤维软骨带重建的研究文献,并总结分析.结果 TDSCs具有向骨细胞、纤维软骨细胞及肌腱细胞分化的能力,因此具备形成纤维软骨带的潜能;决定TDSCs成骨、成软骨分化的因素有力学刺激、生物活性因子、细胞外基质及炎性因子等.结论 TDSCs因其来源的特殊性,具有成为重建BTJ纤维软骨带种子细胞的潜能,通过外界刺激可诱导TDSCs形成类似于纤维软骨带结构.
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深温冷冻对大鼠髌腱组织内肌腱干细胞生物学特性影响的研究
目的 探讨深低温冷冻处理对大鼠髌腱组织中肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的成活、细胞活力、早期凋亡、迁移能力及肌腱相关基因表达的影响.方法 取12只4月龄雄性SD大鼠双侧髌腱组织,其中6只大鼠12条髌腱组织(实验组)进行深低温冷冻处理;剩余髌腱组织(对照组)不作处理,作为正常对照.取两组髌腱组织用0.3％Ⅰ型胶原酶消化获得有核细胞,分别用锥虫蓝染色检测有核细胞成活率、结晶紫染色检测有核细胞克隆形成能力;取两组髌腱组织分离培养TDSCs,并传至第3代,采用Alamar Blue法检测细胞体外增殖能力;Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡率;Transwell法检测细胞迁移能力;实时荧光定量PCR检测细胞肌腱相关基因Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,Col1α1)、scleraxis (Scx)和tenomodulin (Tnmd) mRNA表达.结果 与对照组(91.00％±3.63％)比较,实验组原代有核细胞成活率为61.65％±4.76％,差异有统计学意义(t=12.010,P=0.000).两组有核细胞接种后,均呈克隆样生长;培养12d,实验组每1 000个有核细胞克隆集落形成数为(8.41±0.33)个,较对照组(15.19±0.47)个显著减少(t=28.910,P=0.000).实验组TDSCs占活性有核细胞比例为1.37％±0.09％,较对照组1.67％±0.10％显著减少(t=5.508,P=0.003).第3代TDSCs培养14d内两组细胞生长趋势一致;两组各时间点吸光度(A)值比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).实验组及对照组TDSCs早期凋亡率分别为1.67％±0.06％、1.63％±0.06％,比较差异无统计学意义(t=0.707,P=0.519).镜下见,两组均有TDSCs黏附于Transwell小室下室,实验组细胞数为(445.00±9.70)个,对照组为(451.50±12.66)个,比较差异无统计学意义(t=0.998,P=0.342).实验组Col1α1、Scx、Tnmd的mRNA相对表达量分别为3.498±0.065、0.062±0.002、(4.211±0.211) ×10-5,对照组分别为3.499±0.113、0.062±0.001、(4.341±0.274) ×10-5,比较差异均无统计学意义(t=0.013,P=0.991;t=0.042,P=0.969;t=0.653,P=0.549).结论 大鼠肌腱组织经深低温冷冻后其有核细胞成活率降低,但肌腱组织仍保留大量有活性TDSCs,且细胞增殖能力、早期凋亡率、体外迁移能力及成肌腱分化能力未见明显异常.
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不同机械牵伸条件对大鼠肌腱干细胞分化的影响
目的 探讨不同机械牵伸条件对肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)分化的影响,寻求TSCs成肌腱分化、成骨分化以及成脂肪分化的佳单轴循环牵伸载荷.方法 取8周龄雄性SD大鼠跟腱,采用酶消化法分离培养TSCs.取第3代TSCs,随机分为不同牵拉条件组(实验组A～D组)及静态培养组(对照组E组),其中A组牵拉强度4％、频率1 Hz,B组牵拉强度4％、频率2 Hz,C组牵拉强度8％、频率1 Hz,D组牵拉强度8％、频率2 Hz.利用课题组自行研发的体外细胞单轴循环牵拉设备,沿培养皿长轴对A～D组细胞进行单轴循环机械牵伸,E组细胞行静态培养.分别处理12、24、48 h后收集各组细胞,采用实时荧光定量PCR检测成腱分化相关基因Scleraxis (SCX)、抗细胞黏合素C(Tenascin C,TNC),成脂肪分化相关基因CCAAT/增强子结合蛋白-α(CCAAT-enhancer-binding protein-α,CEBPα)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,LPL)及成骨分化相关基因RUNX2、远端缺失基因5(distal-less homeobox 5,DLX5)的表达;Western blot检测TNC、CEBPα及RUNX2蛋白表达.结果 实时荧光定量PCR检测示:SCX、TNC mRNA相对表达量在B组牵拉24 h时显著高于其余各组,差异有统计学意义(P＜0.05);CEBPα、LPL mRNA相对表达量在D组牵拉48 h时显著高于其余各组,差异有统计学意义(P＜0.05);RUNX2、DLX5 mRNA相对表达量在C组牵拉24 h时显著高于其余各组,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测示:B组牵拉各时间点TNC蛋白表达均高于E组(P＜0.05),同时牵拉24 h与E组相比CEBPα表达有显著抑制作用(P＜0.05);C组牵拉24 h RUNX2蛋白表达显著高于E组(P＜0.05),同时牵拉24、48 h TNC蛋白表达显著低于E组(P＜0.05);D组牵拉48 h CEBPα蛋白表达显著高于E组(P＜o.05),TNC蛋白表达显著低于E组(P＜0.05),RUNX2蛋白表达与E组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 机械力学刺激可以促进TSCs发生分化,而且不同条件的牵拉载荷会引起不同方向分化.4％、2 Hz牵拉24 h为成腱分化佳条件,8％、1 Hz牵拉24h为成骨分化佳条件,8％、2 Hz牵拉48 h为成脂肪分化佳条件.
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循环牵拉对大鼠跟腱来源肌腱干细胞c-fos基因表达的影响
目的 探讨机械刺激对大鼠跟腱来源肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)立早基因c-fos表达的影响.方法 取8周龄雄性SD大鼠跟腱组织,用酶消化法分离、培养TSCs,取第3代细胞用于实验.利用单拉循环牵伸载荷模型在1 Hz条件下,分别用4％和8％牵拉强度牵拉细胞,并在牵拉0、5、15、30、60、120 min后收集细胞进行实时荧光定量PCR检测,观察c-fos mRNA相对表达量随牵拉时间的变化,并找到表达高时间点Tmax.然后分别用2％、4％、6％、8％和12％的牵拉强度,在牵拉Tmax时收集细胞,观察c-fos mRNA相对表达量随牵拉强度的变化.接着分别用2％、4％、6％、8％和12％的牵拉强度,对TSCs经0、5、15 min短时间牵拉后静置至Tmax,观察c-fos mRNA相对表达量经短时刺激后的变化情况.后分别用4％和8％牵拉强度牵拉细胞0、Tmax120 min,检测成肌腱分化标志基因Ⅰ型胶原、腱调蛋白(tenomodulin,TNMD),成骨分化标志基因Runx2、远端缺失基因5 (distal-less homeobox 5,Dlx5),成脂肪分化标志基因脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)的表达情况.结果 与0 min相比,在4％和8％牵拉强度下,c-fos mRNA相对表达量在牵拉15 min时显著升高(P＜0.05),30 min时出现峰值(P＜0.05),至60 min时表达量恢复至起始水平(P＞0.05);故Tmax为30 min.牵拉30 min时,2％的牵拉强度即可使c-fos mRNA相对表达量升高,且6％、8％和12％牵拉强度较2％、4％牵拉强度进一步升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).经过5 min的短时间牵拉,并静置至30 min时即可使c-fosmRNA相对表达量升高(P＜0.05).4％牵拉强度下,在牵拉30 min和120 min时,各分化标志基因相对表达量与0 min比较差异均无统计学意义(P＞0.05);而8％牵拉强度下,在牵拉30 min时,Runx2基因相对表达量显著升高,在牵拉120 min时,Ⅰ型胶原、TNMD、Dlx5、Runx2等基因相对表达量均升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 循环牵拉能够影响大鼠跟腱来源TSCs立早基因c-fos的mRNA表达,并且呈时间和强度依赖性;提示机械刺激的时间和强度可能在作用早期即对TSCs的分化产生影响,对进一步研究TSCs机械-细胞内信号耦联机制具有重要意义.
