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p,p'-DDE和β-BHC联合染毒对孕小鼠生殖及其胎仔发育的影响
目的研究p,p'-DDE和β-BHC联合染毒对孕小鼠生殖和胎仔发育的影响.方法对孕12～14天小鼠每天联合灌胃不同剂量的p,p'-DDE和β-BHC(各1、5、10mg/kg bw),并设植物油溶剂对照组,采用磁性分离酶联免疫法检测孕鼠血清雌二醇(E2)和孕酮(P)含量,RT-PCR检测小鼠胎盘组织中雌激素受体(α-ER)、促性腺激素释放激素(GnRH)和β-内啡肽(β-EP)mRNA表达水平.结果①生殖影响:随染毒剂量加大母鼠子宫剥离重和子宫腔内液增加,子宫着床数减少,胎仔肛殖距和雌雄比增加,孕鼠血清中雌二醇和孕酮水平上升,胎盘组织α-ER和GnRH mRNA表达上调而β-EP mRNA表达下调,且均呈现剂量依赖性关系,差异有显著性(P＜0.05).②发育影响:随染毒剂量增加孕鼠体重增长减少,肝脏的脏器系数增加,活胎数下降,不良妊娠结局(死胎、吸收胎和畸形数)增多,雌胎数所占比例加大,均呈剂量效应关系,差异有显著性(P＜0.05).结论p,p'-DDE和β-BHC可干扰孕小鼠生殖功能,导致生殖和发育障碍,造成雌雄比例失衡.
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HIV-1 gp41基因片段亚型多样性研究
[目的]应用HIV-1 env gp41基因分型技术进行出入境HIV感染者HIV-1亚型多样性研究.[方法]采用套式逆转录PCR方法对env gp41和gp120(C2-V3区)进行基因扩增、测序、亚型对比分析,以及应用威斯康星GCG公司软件进行系统树分析和用美国Los Alamos国家实验室的HIV-Blast软件进行序列的亚型鉴定.[结果]对22份样本的gp41和gp120(C2-V3区)的基因亚型进行对比分析,结果表明gp41和gp120(C2-V3区)在亚型上具有一致性.对65例来自中国、非洲、欧洲、美洲和东南亚的出入境HIV-1阳性者进行gp41扩增基因亚型分析,发现有A、B、C、D、F1、G亚型和重组亚型AC、01_AE、02-AG、07_BC、08_BC、06_cpx、18 cpx共计13种亚型,其中重组株占33.8%(22/65).中国籍出入境感染者包括了A、B、C、D、F1、G亚型和重组亚型01_AE、02_AG、07_BC、08_BC在内的10种亚型,其中重组株占25%(7/28).[结论]用gp41替代gp120(C2-V3区)进行HIV-1亚型分析较为理想.出入境人群中HIV感染者感染的HIV毒株几乎包括了全球流行的所有亚型,多种国内少见的亚型已经通过国际旅行者传入国内.
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银杏叶提取物对肺纤维化模型大鼠肺组织MMP-2mRNA表达的影响
目的 观察银杏叶提取物对肺纤维化大鼠不同时间点肺组织MMP-2mRNA表达的影响.方法 96只健康Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、强的松组(C组)和银杏叶提取物干预组(D组),每组各24只,除A组外,其余各组采用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型.造模第2天起,D组用银杏叶提取物灌胃,C组用醋酸强的松混悬液灌胃,A、B组用生理盐水灌胃.每组分别于造模后第7、14、28天随机取8只大鼠,处死后采集肺组织,抽提RNA,采用RT-PCR法得到MMP-2mRNA产物,用琼脂糖凝胶电泳和图像分析方法观察MMP-2 mRNA的表达.结果 各实验组在各时间点均有MMP-2mRNA的表达,与A组相比,B组第7天含量显著升高(P＜0.01),第14天时达到高峰,第28天虽较第7、14天时有所降低,但仍明显高于同期A组(P＜0.01).与B组比较,C、D组各时间点含量均明显降低(P＜0.01).结论 造模后各组MMP-2mRNA表达增强,银杏叶提取物能够有效抑制MMP-2mRNA的过度表达,从而对肺损伤和肺纤维化起到一定的防治作用.
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复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达影响的研究
观察复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原(CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(CoL-Ⅲ)mRNA表达影响.以不同剂量复方861灌胃大鼠制备的含药血清,作用HSC-T6细胞48h,应用逆转录定量PCR方法测定其对HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达的影响.结果表明:复方8610.5、1.0、2.0、6.0g/kg等不同剂量含药血清HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达.与空白对照组比较,具有显著性(P＜0.05或P,0.01).因此,复方861可降低HSC-T6细胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表达水平,具有抗肝纤维化作用.
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EV71病毒核酸快速检测方法的比较
PCR方法检测肠道病毒71型(EV71)的分子诊断技术十分快速敏感.目前已有多篇文献报道了不同的检测EV71的PCR方法,但对不同方法检测结果的比较还少有报道.本研究将检测肠道病毒通用5′UTR基因的3种定量PCR(rRT-PCR)方法和1种普通PCR(cRT-PCR)方法和特异性检测EV71的2种rRT-PCR和1种cRT-PCR方法进行特异性和敏感性比较评估.所有试验方法都有较好的特异性,无交叉反应.核酸低检测限值为从8.19× 101～8.19×105个拷贝,rRT-PCR比cRT-PCR更敏感.所有的rRT-PCR方法检测50份临床标本时都较敏感.
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钠氢转运蛋白2敲出小鼠破骨细胞分化研究
目的 建立NHA2基因敲出小鼠模型,观察NHA2 -/-小鼠骨髓细胞分化为破骨细胞的能力及生长表型变化.方法 首先用NHA2+/-杂合子小鼠繁殖得到NHA2 -/-纯合子小鼠；以小鼠尾巴为材料做普通PCR鉴定其基因型；用RT-PCR检测基因敲出小鼠NHA2转录情况；从小鼠中取出骨髓进行破骨细胞诱导,观察其分化能力.结果 NHA2 -/-小鼠骨髓细胞体外诱导成成熟破骨细胞能力减弱；但小鼠生长表型无明显变化.结论 NHA2作为盐离子载体在体外对破骨细胞的成熟分化有一定影响,在小鼠体内可能与其它离子载体共同调节盐平衡系统.
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依普拉芬对新生大鼠颅盖骨成骨细胞BMP-2和TGF-β1 mRNA表达的影响
目的 研究依普拉芬对体外培养的原代大鼠成骨细胞BMP-2(Bone Morphogenic Protein-2,骨形态发生蛋白-2)和TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1,转化生长因子-β1)mRNA表达的影响,探讨其预防绝经后骨质疏松的机制.方法 体外分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞,取第二代细胞,将不同浓度的依普拉芬加入培养液,72 h后用RT-PCR技术检测各组细胞BMP-2和TGF-β1mRNA表达情况.结果 与阴性对照组比较,各浓度组的依普拉芬均可使成骨细胞BMP-2和TGF-β1mRNA表达量显著增加(P＜0.01),其中,依普拉芬浓度在10-8～10-5 mol/L之间作用为显著.结论 10-8～10-5mol/L浓度范围内的依普拉芬均可促进成骨细胞BMP-2和TGF-β1mRNA的表达,从而间接促进其增殖和分化,增加骨形成.
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重组腺病毒载体介导人OSM 基因对胰腺癌细胞增殖的抑制作用及对裸鼠致瘤性的影响
目的构建了含人抑瘤素M(human oncostatin M,hosm)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体,观察其对胰腺癌细胞株BxPC3在体外生长抑制情况及在裸鼠致瘤性改变的作用,为胰腺癌的基因治疗提供参考.方法用含hosm基因的缺陷型腺病毒载体转染人胰腺癌细胞株,用RT-PCR法检测外源hosm基因在其中的表达;苔盘蓝染色、细胞计数法检测ad-hosm对BxPC3的体外增殖抑制情况;裸鼠皮下接种转染ad-hosm的BxPC3 ,观察其对肿瘤形成率的影响.结果 hosm基因在转染细胞能有效的表达.体外试验示ad-hosm能明显抑制BxPC3的生长,ad-hosm能抑制BxPC3在裸鼠中的成瘤作用.结论重组腺病毒介导hosm基因表达能有效抑制BxPC3在体外、体内的增殖,提示重组腺病毒介导的hosm基因治疗可能成为胰腺癌治疗的侯选方案.
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铜绿假单胞菌群体感应QS系统对Ⅰ类整合子intI1基因调控作用的初步研究
目的 研究铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子阳性株群体感应系统基因lasR与Ⅰ类整合子整合酶基因intI1表达水平的相关性,初步探讨群体感应系统对Ⅰ类整合子的调控机制.方法 通过荧光定量RT-PCR方法检测铜绿假单胞菌群体QS信号分子受体基因lasR和Ⅰ类整合子整合酶基因intI1在生物被膜中与阿奇霉素菌液中mRNA的表达水平,分析两基因表达的相关性.结果 铜绿假单胞菌群体感应系统lasR基因及Ⅰ类整合子intI1基因表达水平在生物被膜中均较在阿奇霉素菌液中升高(P＜0.05),且两者表达水平呈正相关性(r=0.565,P＜0.05).结论 铜绿假单胞菌群lasR和intI1基因表达呈正相关,且阿奇霉素对Ⅰ类整合子intI1基因表达抑制作用明显,提示intI1基因表达可能与群体感应系统的调控作用有关.
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毒力基因pspA在肺炎链球菌入侵血液系统中的作用研究
目的：研究不同来源肺炎链球菌（SPN）刺激THP-1细胞和A549细胞前、后毒力基因 pspA表达的变化，探讨其在SPN入侵血液中的作用。方法从住院患者分离、搜集23株SPN ，与SPN标准株ATCC49619一起进行培养，并提取RNA ；T HP-1和A549细胞经培养后调至一定浓度，再分别用上述24株SPN在37℃5％ CO2环境下分别刺激4 h和8 h；然后，搜集细胞悬液进行离心，沉淀物用于RNA的提取；用荧光实时定量逆转录PCR法对刺激前、后毒力基因 pspA的mRNA与16s rRNA进行同时测定，用SPSS17．0软件进行数据分析。结果临床SPN刺激THP-1和A549细胞后毒力基因 pspA的△Ct值均低于刺激前；临床SP株毒力基因 pspA的△Ct值与ATCC49619间，血源性和痰源性SPN相比，刺激细胞后 psaA的△Ct值间差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论临床SPN刺激T HP-1和A549细胞后毒力基因 pspA的表达均有上调，临床SPN株毒力基因 pspA的表达与ATCC49619不同；毒力基因 pspA表达的异化可能是血源性SPN入侵血液的原因之一。
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休克期切痂对大鼠肝组织ICAM-1及TNF-α mRNA表达的影响
为研究烧伤后肝组织细胞间粘附分子-1（ICAM-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达及肝组织髓过氧化物酶（MPO）的规律，论证及早切除焦痂的重要性，取大鼠176只，30％Ⅲ度烫伤，观察伤后不同时相点及不同时机切痂后肝组织ICAM-1、TNF-α mRNA的表达及肝组织MPO活性变化。结果显示，烫伤后肝组织ICAM-1及TNF-α的mRNA表达在伤后4h即已升高，8h和24h切痂组动物伤后96h恢复正常。未切痂组和96h切痂组在伤后7天仍未恢复正常；休克期切痂组MPO活性96h恢复正常，未切痂组和非休克期切痂组伤后7天仍未恢复正常。提示及早切痂去除了坏死组织，减轻了由粘附分子介导的中性粒细胞对内皮细胞的进一步损害。
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卵巢癌组织中GST-π和MDR1基因的表达及其意义
目的:观察两种耐药基因谷胱甘肽S-转移酶-pi(GST-π)和MDR1在卵巢癌组织中mRNA水平的表达情况,探讨其表达的意义及应用价值.方法:采用逆转录PCR方法检测了18例卵巢癌和10例正常卵巢组织中GST-π和MDR1的表达,应用β-肌动蛋白作为内对照进行定量分析比较.结果:GST-π和MDR1在正常卵巢组织中表达的阳性率分别是20%和10%,在卵巢癌中的阳性表达率分别是61.1%和33.3%.GST-π在癌组织表达高于正常组织,两者比较P<0.05;而MDR1在癌组织表达虽高于正常组织但无统计学意义;在癌组织中有4例同时出现了GST-π和MDR1的共表达;GST-π mRNA水平的表达低于蛋白水平的表达.结论:(1)GST-π和MDR1在卵巢癌组织中的表达均高于正常卵巢组织,但以GST-π为主;(2)GST-π和MDR1在癌组织中的表达不一致,说明两者的作用机制不同;而共表达现象的存在,又说明GST-π和MDR1可能有相同的调节因素存在;(3)GST-π mRNA水平的表达低于蛋白水平的表达,提示GST-π表达还存在转录后加工和(或)翻译水平的调控.
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庚型肝炎病毒(HGV RNA)基因的定量检测
目的:建立庚型肝炎病毒基因(HGV RNA)的定量检测方法.方法:采用荧光转换原理,应用特异荧光物质标记的引物进行逆转录PCR(RT-PCR),检测41例临床血清标本的HGV RNA.结果:与巢式定性PCR结果比较,两者具有相关显著性.以定量实验为标准定性实验的阳性漏检率为3.33%,阴性漏检率为18.1%,两者相对符合率为92.68%.结论:定量检测HGV RNA在定性的基础上提供了量的结果,而且具有特异性强、结果稳定、操作简便等特点.
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增强型RACE技术克隆辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1
目的在获得了辐射诱导小鼠肠上皮新基因RS1 EST序列的基础上获得全长cDNA.方法RT-PCR方法对RS1基因进行表达谱分析,找到表达丰度较高的组织提取总RNA作为模板,应用增强RACE技术即结合生物素探针富集靶cDNA的方法克隆RS1的cDNA末端.结果克隆到RS1片段3′端约2kb的序列.该序列5′端包含已知的RS1片段,3′端具有明显的polyA加尾信号,有编码区的终止密码子.明确了RS1的正、负链及其蛋白编码方向,为RS1 5′端的克隆提供了必要信息.结论结果与本实验的设计完全一致,说明这一方法对从表达丰度低,难以设计佳基因特异性引物的EST序列克隆其对应的全长cDNA是可行的,同时为下一步研究RS1在小鼠肠上皮辐射应激反应中的作用和被辐射诱导表达的调控模式奠定了基础.
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洛拉曲克对3株肿瘤细胞胸苷酸合成酶mRNA水平的影响
目的研究3株肿瘤细胞的胸苷酸合成酶mRNA(thymidylate synthase,TS mRNA)水平在洛拉曲克作用后的动态变化规律.方法细胞用不同剂量的洛拉曲克处理不同的时间后提取总RNA,用逆转录多聚酶链式反映(RT-PCR)检测TS mRNA/β-actinmRNA的比率反映TS mRNA的动态变化.结果BT-PCR结果显示,在3种肿瘤细胞的时间曲线中,TS/β-actin比值与对照相比均有一定的变化趋势.但3种细胞的变化趋势各不相同,C6细胞呈升高后平台形,SRS-82细胞是升高后又降低呈峰形,LoVo细胞呈持续升高的趋势.在剂量曲线中,除LoVo细胞变化不明显以外,其余两种细胞表现相似,即浓度在IC90值附近或比其低浓度的洛拉曲克可使TS/β-actin比值升高,但更高浓度则使比值降低,表现出细胞毒性.结论尽管理论上经洛拉曲克作用后不应该影响TS mRNA水平,但本实验证明TS mRNA水平在洛拉曲克作用下确有动态变化,提示洛拉曲克药理作用的复杂性.
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1073例儿童手足口病病原学检测结果及临床特征分析
目的 了解手足口病(HFMD)儿童病例中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)的感染状况及重症HFMD病例的临床特征和实验室检查结果.方法 采集HFMD患儿咽拭子标本,检测EV71和CA16感染情况,分析患儿性别、年龄分布情况并对重症患儿的临床特征和实验室检查结果进行回顾性分析.结果 1073例HFMD患儿中EV71阳性494例(46.04%),CA16阳性97例(9.04%),EV71阳性检出率明显高于CA16(P=0.001).494例EV71阳性患儿中,男299例(60.53%),女195例(39.47%);97例CA16阳性患儿中,男59例(60.82%),女38例(39.18%),男性患儿构成比显著高于女性.EV71或CA 16阳性患儿中"1～＜2岁"组和"2～＜3岁"组构成比明显高于其他年龄组.本组重症病例62例,其中重型50例(80.65%),危重型12例(19.35%).前者以神经系统表现为主,循环系统、呼吸系统轻度受累,无死亡病例;后者并发神经系统、循环系统、呼吸系统等多器官功能损害,5例死亡.结论 2010年北京地区HFMD流行的病原体的优势株可能为EV71;男性患儿高于女性,1～3岁儿童为易感人群.危重型可引起死亡,实验室指标的变化对协助诊断重型HFMD及提示重型向危重型进展有一定意义.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 逆转录PCR -
荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估
目的 建立灵敏、特异的诺如病毒基因Ⅱ型的荧光定量RT-PCR方法,用于临床腹泻粪便样本病毒的定量检测.方法 构建质粒DNA,并转录合成RNA作为标准品,建立和优化诺如病毒基因Ⅱ型荧光定量RT-PCR方法和反应体系,评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测.结果 此方法低可以检出102拷贝数/μl,能特异地检出诺如病毒基因Ⅱ型,与诺如病毒基因Ⅰ型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应.针对标准品,2次批内试验的荧光信号循阈值(Ct值)变异系数(CV)分别为1.60％、0.70％,2次批间试验的变异系数(CV)分别为0.40％、0.40％,均在5％以下.结论 本研究建立的实时定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型的方法,其灵敏度、特异性和重复性良好,可用于该病毒的快速检测.
关键词： 诺如病毒 基因Ⅱ型 逆转录PCR 实时荧光定量RT-PCR -
乳腺癌前哨淋巴结中细胞角蛋白19的表达及临床意义
目的 检测乳腺癌前哨淋巴结(SIN)组织中细胞角蛋白19(CK19)在mRNA和蛋白水平的表达情况,以探讨检测淋巴结CK19的表达对预测乳腺癌前哨淋巴结微转移的临床价值.方法 本组30例可手术的原发性乳腺癌患者,手术中均行肿块周围或乳晕周围注射亚甲蓝进行SLN定位成功,同时常规行腋窝淋巴结清扫,术后对SLN和非SLN均行常规病理学检测,对SLN同时采用RT-PCR和Western Blot方法检测CK19的表达.结果 30例SLN常规病理检测发现8例阳性SLN,阳性率为26.67%(8/30),1例假阴性.应用RT-PCR方法和Western Blot方法检测30例SLN中CK19的表达,结果HE染色阳性的8例SLN及1例假阴性SLN均呈阳性表达,共有12例SLN CK19mRNA表达阳性,阳性率为40.0%(12/30);Western Blot检测发现1I例SLN CK19呈阳性,阳性率为36.67%(11/30).RT-PCR、Western Blot检测结果分别与HE染色结果比较,差异均有统计学意义(P<0.05),假阴性率为0.结论 CK19mRNA可作为标志物来检测乳腺癌SLN中的微转移情况;RT-PCR方法可检测到SLN微转移灶,通过SLN定位后检测其中CK19mRNA的阳性表达,可明显提高乳腺癌SLN的阳性率,降低SLN单纯病理检测的假阴性率.
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中药复方对糖尿病大鼠血管内皮核因子和单核细胞趋化蛋白-1 mRNA表达的影响
目的 探讨中药复方糖脉平对2型糖尿病大鼠血管内皮核因子(NF-κB)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达的影响.方法 将大剂量链脲佐菌素腹腔注射(STZ 60mg/kg)造模成功的Wistar大鼠随机分为模型组、糖脉平组、二甲双胍组、玉泉丸组,每2周称1次体质量并剪尾测血糖,第6周处死取主动脉标本,采用免疫组化SAB法测定NF-κB及半定量RT-PCR法检测MCP-1 mRNA表达情况.结果 造模后,大鼠血糖及NF-κB和MCP-1 mRNA的表达明显增高,经治疗后,糖脉平组及二甲双胍组NF-κB和MCP-1 mRNA的表达明显降低,与模型组比较有显著性差异(P均<0.01).结论 糖脉平能减少糖尿病大鼠NF-κB和MCP-1 mRNA的表达,减轻血管内皮局部炎症反应,阻断和降低动脉硬化的形成.
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人牙髓组织中TLR-2的表达研究
目的：探讨Toll样受体-2（TLR-2）在人牙髓组织中的分布与表达。方法对10颗健康牙髓和10颗炎症牙髓分别进行免疫组化和逆转录实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测，研究TLR-2的分布与表达。结果 TLR-2在健康人牙髓组织中表达呈阴性，在炎症牙髓组织中表达呈阳性。炎症牙髓组织中TLR-2阳性表达率显著高于健康牙髓组，差异有统计学意义（P<0.01）。2组牙髓组织标本总RNA RT-PCR扩增产物电泳显示，炎症牙髓标本均在β-actin条带之上368bp位置出现条带，而健康牙髓标本未见对应条带。结论 TLR-2在炎症牙髓组织中存在弱阳性表达，提示TLR-2可能参与了人牙髓组织的炎症和免疫反应。
