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牙胚细胞体外培养过程中成牙基因的表达
背景：多项实验表明牙胚组织在不同的时间点有不同的基因发挥作用，共同促进牙胚发育。
目的：观察牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1在大鼠牙胚细胞体外培养的不同时间的表达。
方法：对体外培养后第1，3，6天的牙胚细胞提取RNA，反转录后采用实时定量PCR的方法检测牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1mRNA相对表达水平的变化。
结果与结论：牙胚细胞中牙本质基质蛋白1、成釉蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达随培养时间的延长而增加，在培养3 d时达到峰值(P<0.05)，而同源异型盒基因1 mRNA的表达随培养时间的延长而下降(P<0.05)。 -
釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达
目的:比较小鼠釉原蛋白(amelogenin,AMELX)、成釉蛋白(ameloblastin,AMBN)和釉蛋白(enamelin,ENAM)在牙胚组织发育过程中表达的差异,从而揭示其不同的功能.方法:选择牙胚发育期分别位于钟状期、钟状晚期、釉质成熟期的昆明小鼠头颅切片,使用抗鼠AMELX、AMBN和ENAM多克隆抗体(由美国德州大学健康科学中心Dr.Simmer赠送),行免疫组织化学EnVision二步法染色,观察三种蛋白在处于三个不同发育阶段小鼠头颅切片中的表达情况.结果:免疫组化结果显示,三种蛋白在三种小鼠牙胚的成釉细胞、釉质、牙本质中的表达存在时空顺序差异,随着牙胚发育和釉质成熟,AMELX呈递减表达,而AMBN和ENAM则较恒定表达.AMELX在周围发育中的编织状骨组织中也有微弱表达.结论:AMELX、AMBN和ENAM为主要的釉质基质蛋白,在牙胚发育的不同阶段有不同的调节矿化的作用,AMELX在釉质矿化早期促进晶体生长,而其在骨中的表达则进一步表明其在骨修复中可能的作用;AMBN促进釉质基质矿化,并维持晶体形状、大小;ENAM促进和维持晶体生长,并与再矿化有关.
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MMP-9基因敲除小鼠磨牙牙胚中釉原蛋白和成釉蛋白表达的研究
目的:检测MMP-9基因敲除小鼠(MMP-9 /)和野生型小鼠磨牙牙胚中釉原蛋白和成釉蛋白的表达.方法:使用免疫组化方法检测出生后2 d(P2)、5 d(P5)、7 d(P7)野生型小鼠和MMP-9-/-小鼠下颌磨牙牙胚中釉原蛋白和成釉蛋白的表达分布.结果:在P2时,釉原蛋白主要表达在成熟的成釉细胞胞、及其相邻的成牙本质细胞内,敲除MMP-9后,釉原蛋白的表达可扩散至牙乳头间充质;在P5和P7时,釉原蛋白的表达分布在野生型小鼠和MMP-9-/-小鼠中无差异,但在MMP-9-/小鼠中釉原蛋白在成釉细胞中的表达量明显增强.在P2、P5和P7时,成釉蛋白的表达分布和表达量在野生型小鼠和MMP-9 /-小鼠中均无差异.结论:MMP-9可能通过酶切釉原蛋白而影响其表达分布.
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BMP-2、bFGF基因转染的大鼠骨髓干细胞与牙胚细胞在体外混合培养对成牙基因的影响
目的:观察骨形态发生蛋白-2和(或)碱性成纤维细胞生长因子转染的大鼠骨髓干细胞(BMSCs)和牙胚细胞在体外混合培养对牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、同源异型盒基因1的影响.方法:采用实时定量PCR和Western blot的方法,检测BMP-2和(或)bFGF对成牙基因的影响.结果:对照组、bFGF组、BMP-2组、bFGF/BMP-2组四组间,AMBN、COLLAGEN-Ⅰ、DLX1、DMP1基因在mRNA和蛋白水平表达量上存在明显差异(P＜0.05).结论:BMP2和bFGF有一定的协同交互作用,BMP2/bFGF/BMSCs/牙胚细胞可以作为构建组织工程牙的种子细胞.
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人牙源性上皮细胞的体外培养研究
目的:建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法,为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源.方法:采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞,用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化,在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况.结果:原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好,但有少量成纤维细胞混杂,经纯化后明显好转,上皮细胞呈片状生长,表达角蛋白及成釉蛋白.传至第5代后,细胞逐渐变为长梭形,失去上皮细胞形态.结论:体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性,有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞.
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成釉蛋白基因的分子生物学研究进展
成釉蛋白是酸性的非釉原蛋白的组成成分之一,主要分布于釉柱周围,可以控制晶体生长速度,维持晶体生长,并决定釉柱的结构.如果其功能障碍,就会导致釉质发育不全.本文就成釉蛋白的结构、生理活性、表达调控等研究现状和进展作一综述.
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釉蛋白和成釉蛋白在完全形成鼠磨牙上皮根鞘残余上的表达
Hertwig's上皮根鞘(ERS)及其残余在牙根形成中的作用仍存在争议.需要解决的一个关键问题是釉蛋白(amelin)在ERS上的存在及它们是否参与了牙骨质的形成.已有实验证实釉基质诱导剂能促进无细胞性牙骨质再生,但它们对完全形成牙根牙骨质的再生是否有作用仍不清楚,本文进行了研究.材料和方法12只Sprague-Dawley鼠,年龄分别为50,65和85 d.麻醉状态下切除其上颌骨,经上颌第一磨牙根中部制作矢状组织切片,厚度为7μm.应用釉蛋白和成釉蛋白(amelogenin)mRNAS位点杂交技术和免疫组织化学方法检测ERS上皮细胞中是否存在釉蛋白和成釉蛋白,同时应用抗表皮角蛋白抗体确定上皮根鞘残余.结果和讨论所有鼠磨牙根颈1/2为无细胞性牙骨质,根尖部位为细胞性牙骨质.牙本质和细胞性牙骨质接界处有一层上皮细胞,含有并能合成釉蛋白,但不能合成成釉蛋白.另有一类细胞,它们全部或部分包含在细胞性牙骨质中,形成岛状或束状,同时含有并能合成釉蛋白和成釉蛋白.还有一类上皮细胞,位于细胞性牙骨质的周围和无细胞性牙骨质的表面,不存在也不能合成釉蛋白和成釉蛋白.本研究结果表明,鼠磨牙某些ERS残余的上皮细胞存在并能合成釉蛋白或成釉蛋白,但它们有明显的区域性差异和种类差异.它们均参与了牙根的形成和发育,但釉蛋白和成釉蛋白在鼠牙根部硬组织形成和牙周组织维持中的作用尚需进一步研究.[赵光华摘 王学侠校]
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Runx2在牙釉质形成中的作用研究
目的:研究小鼠成釉细胞中Runx2对釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)、成釉蛋白(Ameloblas-tin,AMBN)、牙成釉细胞相关蛋白(odontogenic ameloblast-asssociated protein,ODAM)基因表达的调控作用,为研究Runx 2在牙釉质形成中的作用奠定基础.方法:通过RT-PCR法从小鼠成釉细胞中克降得到Runx 2全长基因,测序正确后将其亚克隆至pcDNA3.1-hisA载体中;构建针对小鼠Runx 2的siRNA表达框架,将反应质粒pcdna-3.1-HisA-Runx 2及针对Runx 2的特异性小分子干扰RNA(siRNA)分别转染小鼠成釉细胞,用RT-PCR方法检测Runx 2,AMTN,AMBN以及ODAM的mRNA水平.结果:转染的小分子干扰RNA(siRNA)对Runx 2mRNA的表达有显著性抑制作用,Runx 2基因沉默可显著抑制AMTN和AMBN的mRNA表达水平;Runx 2基因过表达可显著上调AMTN和AMBN的mRNA表达水平.Runx 2基因的表达变化对ODAM的mRNA表达水平则无显著性调控作用.结论:Runx 2通过调控AMTN和AMBN的表达水平,在牙釉质形成过程中发挥作用.
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人成釉蛋白基因在COS-7细胞中的表达
目的:通过构建真核表达载体,在COS-7细胞中表达人成釉蛋白基因.方法:分别将人成釉蛋白基因克隆入非融合和融合真核表达载体pcDNA 3.1和pEGFP-C3中,证实克隆正确后,用脂质体介导将载体转染哺乳动物细胞COS-7,通过免疫组织化学、Western Blot等方法检测成釉蛋白在哺乳动物细胞中的表达.结果:表达的绿色荧光蛋白融合蛋白所发出的荧光位于细胞浆中,胞核中无荧光,与免疫组化结果一致,说明人成釉蛋白位于细胞浆中.Western Blot检测显示在COS-7细胞中表达的成釉蛋白的分子量为65×103,分泌至培养基中的成釉蛋白的分子量为62×103.结论:成功在哺乳动物细胞中表达了人成釉蛋白,为研究成釉蛋白合成后的修饰加工和成釉蛋白的结构,为今后进一步研究成釉蛋白结构和功能的关系奠定了基础.
关键词： 人 成釉蛋白 免疫组化 绿色荧光蛋白 Western blot -
成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位
目的:观察成釉蛋白 (ameloblastin,AMBN)在小鼠牙胚发育不同时期的表达和分布情况.方法:采用免疫组化的方法观察AMBN在小鼠牙胚不同时期的表达和定位.结果:蕾状期、帽状期和钟状早期牙胚中未见AMBN的表达;出生后1 d钟状期,在成釉细胞和釉基质中呈强阳性表达,成牙本质细胞和牙本质基质中呈弱阳性表达;出生后3 d,在成釉细胞胞浆中呈弱阳性表达,在成牙本质细胞中表达阳性,着色较成釉细胞深;出生后7 d,AMBN在成釉细胞托姆氏突呈弱阳性表达,其余部位呈阴性表达.在牙胚发育的各个时期,AMBN在外釉细胞、星网层细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达.结论:AMBN参与釉基质的形成,可能与牙胚发育中基质形成的信息传递有关.
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人重组成釉蛋白C端肽在大肠杆菌中的表达及初步纯化
目的:在大肠杆菌中表达人重组成釉蛋白C 端肽,并对重组蛋白进行纯化,为进一步制备抗人成釉蛋白抗体和功能研究奠定基础.方法:将编码人成釉蛋白C 端肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pRSET-A上,构建表达质粒pRSET-A-AMBN,以大肠杆菌E. coli BL21(DE3)为宿主菌进行诱导表达,表达产物经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化.结果:工程菌在IPTG诱导3h后,在SDS-PAGE上出现一条新的蛋白带,相对分子量(Mr)为52×103,以可溶形式存在,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度大于95%的人重组成釉蛋白C 端肽.结论:获得Mr为52×103的人重组成釉蛋白C 端肽.
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人成釉蛋白编码区cDNA的克隆和N端肽的融合表达
目的:克隆人成釉蛋白(Ameloblastin)编码区基因并原核表达其N端肽.方法:抽提人牙胚总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录合成人牙胚cDNAs,然后利用PCR方法,从cDNAs中扩增出人成釉蛋白编码区cDNA序列,将所得基因片段插入pGEM-T Easy质粒载体,转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA,通过限制性酶切和核苷酸序列测定鉴定阳性克隆.将所克隆序列的5'端558bp的片段连入原核表达载体pGEX-4T1并在大肠杆菌中诱导表达,SDS-PAGE分析.结果:克隆片段测序结果与GenBank数据库收录的序列一致,经诱导表达见Mr为46×103的融合蛋白.结论:克隆到人成釉蛋白编码区cDNA,并在大肠杆菌中表达了人成釉蛋白N端肽.
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釉质基质特异蛋白--成釉蛋白
成釉蛋白是釉基质特异蛋白之一,由成釉细胞合成分泌,主要分布于釉柱周围.由于不同的转录剪接形式和翻译后修饰,成釉蛋白具多样性.该蛋白含磷酸化和钙结合位点,可能与釉质矿化有关.
