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  • 重组釉原蛋白的提取和纯化

    作者:孙樱林;冯海兰;黄薇

    目的:通过固相化金属亲和层析的方法,获得较高纯度的具有生物活性的重组釉原蛋白.方法:将重组表达质粒pcDNA3.1TM/Am/myc-His(-)B转染至HEK 293A细胞中,用G418持续筛选,培养扩增.收集细胞,加入RIPA细胞裂解液,粗提蛋白.通过镍金属蟹合层析的方法,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot检测,检测蛋白纯化程度和产率.将釉原蛋白冻干,-80℃冻存.结果:SDS-PAGE及Western Blot检测结果表明,蛋白粗提液中有大小约50KDa的重组釉原蛋白表达,经过HisTrapHP column层析,目的蛋白形成了单一条带,纯化率为91.3%.结论:本实验通过固相化金属亲和层析的方法,获得了高纯度的重组釉原蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.

  • 人釉原蛋白真核表达载体体外表达产物生物学活性的检测

    作者:赵川江;章锦才;徐琛蓉;张蕴惠

    目的 探讨人釉原蛋白基因重组质粒PcDNA3.1-AMG的真核细胞转染表达产物是否具有促进牙周组织再生的作用.方法 脂质体介导PcDNA3.1-AMG体外转染COS1细胞,ELISA法检测转染细胞内及其培养上清液中重组釉原蛋白的表达;建立犬牙周组织缺损模型,局部使用转染表达产物冻干粉,8周后通过组织学观察牙周组织再生的情况.结果 PcDNA3.1-AMG转染的COS1细胞内重组釉原蛋白浓度为(0.253 ± 0.075)μg/ml,培养液中浓度为(0.065 ± 0.011)μg/ml;使用转染表达产物8周后,牙周缺损区牙骨质、牙槽骨均有显著再生,并且新生牙骨质为有胶原纤维穿通的无细胞牙骨质.结论 重组质粒PcDNA3.1-AMG在体外转染哺乳动物细胞后能够表达重组人釉原蛋白,并且表达产物具有促进牙周组织再生的生物学活性.

  • 猪牙胚釉原蛋白成熟肽基因原核表达克隆的构建

    作者:程岚;束蓉

    目的 克隆猪釉原蛋白(pAm)成熟肽编码区基因片段,并构建含有该基因的重组原核表达质粒,为制备基因工程化的重组pAm奠定基础.方法 从新生小猪牙胚组织中抽提总RNA,逆转录合成牙胚cDNA,通过PCR扩增pAm成熟肽编码序列(约540 bp),所得目的 基因插入表达载体质粒PGEX4T1,转化大肠杆菌DH5α.重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和核苷酸序列分析鉴定.结果 重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和测序鉴定证实载体质粒PGEX4T1中插入的基因片段与pAm成熟肽基因序列完全相同.结论 从发育期猪牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列可成功构建含有pAm成熟肽基因的重组表达质粒.

  • 肝素对大鼠下切牙釉原蛋白水平及细胞凋亡的影响

    作者:杨婧;赵玮;林家成;刘丽敏

    目的 建立肝素诱导骨质疏松大鼠模型,观察肝素的应用对大鼠下切牙釉原蛋白水平及其细胞凋亡的影响.方法 取24只4周龄清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为两组,实验组每日于腹部皮下注射肝素1 U/g,对照组于相同部位注射等体积0.9%氯化钠溶液.4周后取大鼠右侧股骨测骨密度值.同时取下颌骨,沿正中联合分为两份,一侧颌骨及下切牙脱钙后制作石蜡切片,行釉原蛋白免疫荧光染色;另一侧脱钙后制作石蜡切片,行原位末端标记(TUNEL)染色,观察下切牙细胞的凋亡情况.实验数据采用SPSS 17.0 统计软件包进行统计学分析.结果 实验组大鼠股骨的骨密度值为(0.185±0.006)g/cm2,低于对照组的(0.196±0.011)g/cm2;实验组下切牙釉原蛋白免疫荧光染色强度为(0.0432±0.0043),低于对照组的(0.0570±0.0096);两组骨密度及荧光强度差异均具有统计学意义(P<0.05).实验组未见细胞凋亡发生,对照组可见个别成牙本质细胞及中间层细胞凋亡阳性着色.结论 肝素可诱导大鼠骨质疏松,降低下切牙釉原蛋白表达及抑制细胞凋亡的发生.

    关键词: 肝素 釉原蛋白 凋亡
  • 成釉细胞的培养及其在釉质形成中的作用

    作者:王冠宇

    成釉细胞在牙齿形成过程中起主要作用,能够合成、分泌、重吸收和降解牙釉质基质.釉原蛋白和非成釉蛋白在牙釉质形成中起关键性作用.国内外已成功分离培养出成釉细胞,成釉细胞的培养、增殖及分化受培养液和基质的影响较大.现以国内外发表的文章做基础,就成釉细胞的培养及其分泌釉原蛋白、在牙齿形成中作用做一综述.

  • 釉原蛋白对牙髓硬组织形成的诱导作用

    作者:倪雪岩;姜秋;吕亚林;高野吉郎

    目的:探讨釉原蛋白对牙髓硬组织形成的诱导作用,为釉原蛋白诱导硬组织形成功能的研究提供实验依据.方法:Wistar雄性大鼠16只,随机分为正常对照组和实验组[连续注射环磷酰胺(CP)14 d],采用组织学和免疫组织化学的方法,观察切牙成牙本质细胞及牙髓组织发生的各种变化及与釉原蛋白的关系.结果:实验组注射CP后切牙形成端处于细胞增殖期和分化期的成牙本质细胞和牙髓细胞发生了广泛的水肿、变性甚至部分坏死、消失.牙髓损害区唇侧成釉器对应的牙髓侧,可见骨样牙本质样的硬组织形成;成釉器的增殖端附近可见成釉细胞分化,而且在新生硬组织表面分泌很厚的釉基质,经免疫组织化学染色釉原蛋白呈阳性表达.正常对照组无变化.结论:CP抑制成牙本质细胞形成后,釉原蛋白具有诱导牙髓形成硬组织的作用.

  • 镁硒对氟牙症小鼠牙胚釉原蛋白表达的影响

    作者:王峰;唐成芳;侯铁舟;李洁洁

    目的通过动物实验研究镁硒氟对氟牙症小鼠釉原蛋白表达的影响,为氟牙症的防治提供科学数据.方法80只雄性SPF级ICR小鼠,按体质量采用随机数字表法分为8组:对照组、加镁组、加硒组、镁硒组、加氟组、镁氟组、硒氟组、镁硒氟组,每组10只.对照组、加镁组、加硒组、镁硒组饮用双蒸水,加氟组、镁氟组、硒氟组、镁硒氟组饮用含氟(F-)50 mg/L的双蒸水溶液.对照组和加氟组常规饲料喂养,加镁组和镁氟组用添加硫酸镁(MgSO4·7H2O,162.5 mg/kg)的常规饲料喂养,加硒组和硒氟组用添加亚硒酸钠(Na2SeO3· 5H2O,2.0mg/kg)的常规饲料喂养,镁硒组和镁硒氟组用添加MgSO4·7H2O(162.5 mg/kg)和Na2SeO3·5H2O(2.0 mg/kg)的常规饲料喂养.42 d后处死小鼠,获取切牙标本.免疫组织化学染色观察釉原蛋白,并以灰度值表示结果,灰度值越大,蛋白表达越少.结果光镜下加氟组成釉细胞扭曲变形,细胞内有空泡;镁硒氟组成釉细胞与对照组接近.加氟组釉基质中釉原蛋白的表达(灰度值:131.03±11.14)明显高于其余各组(对照组:143.44±2.52,加镁组:143.73±12.43;加硒组:148.89±2.85;镁硒组:148.38±7.58;镁氟组:145.90±7.00;硒氟组:148.70±4.90;镁硒氟组:151.89±4.59,P均<0.05).加氟组成釉细胞内釉原蛋白的表达(165.49±5.66)明显低于对照组、加镁组、镁氟组、加硒组(151.35±2.52、149.27±11.13、146.21±4.84、150.39±6.65,P均<0.05),硒氟组成釉细胞内釉原蛋白的表达(165.46±5.81)明显弱于加镁组、镁氟组、加硒组(P均<0.05).析因分析显示,镁、硒单独作用对釉原蛋白在基质中的表达有影响(F=4.195、15.009,P均<0.05),氟与镁的交互作用对釉原蛋白在基质中的表达有影响(F=4.402,P<0.05),镁、硒、氟三者的交互作用对釉原蛋白在基质中的表达无影响(F=1.561,P>0.05).氟、镁、硒单独作用对釉原蛋白在成釉细胞内的表达均有影响(F=18.463、9.372、4.741,P均<0.05),氟与镁、镁与硒的交互作用对釉原蛋白在成釉细胞内的表达有影响(F=10.351、5.919,P均<0.05),镁、硒、氟三者的交互作用对釉原蛋白在成釉细胞内的表达无影响(F=1.460,P> 0.05).结论镁对氟中毒小鼠的釉原蛋白表达有拮抗作用,但尚不能认为硒对氟中毒小鼠的釉原蛋白表达有影响.

    关键词: 釉原蛋白
  • 釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达

    作者:王丽珍;李蕾

    目的:比较小鼠釉原蛋白(amelogenin,AMELX)、成釉蛋白(ameloblastin,AMBN)和釉蛋白(enamelin,ENAM)在牙胚组织发育过程中表达的差异,从而揭示其不同的功能.方法:选择牙胚发育期分别位于钟状期、钟状晚期、釉质成熟期的昆明小鼠头颅切片,使用抗鼠AMELX、AMBN和ENAM多克隆抗体(由美国德州大学健康科学中心Dr.Simmer赠送),行免疫组织化学EnVision二步法染色,观察三种蛋白在处于三个不同发育阶段小鼠头颅切片中的表达情况.结果:免疫组化结果显示,三种蛋白在三种小鼠牙胚的成釉细胞、釉质、牙本质中的表达存在时空顺序差异,随着牙胚发育和釉质成熟,AMELX呈递减表达,而AMBN和ENAM则较恒定表达.AMELX在周围发育中的编织状骨组织中也有微弱表达.结论:AMELX、AMBN和ENAM为主要的釉质基质蛋白,在牙胚发育的不同阶段有不同的调节矿化的作用,AMELX在釉质矿化早期促进晶体生长,而其在骨中的表达则进一步表明其在骨修复中可能的作用;AMBN促进釉质基质矿化,并维持晶体形状、大小;ENAM促进和维持晶体生长,并与再矿化有关.

  • 重组人釉原蛋白及猪釉基质蛋白对人骨髓基质细胞成骨作用的比较

    作者:林智恺;束蓉;宋忠臣;程岚;董家辰;张秀丽

    目的:比较全长重组人釉原蛋白(recombinant human amelogenin,rhAm)和猪釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)体外诱导人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)成骨分化的作用,探讨rhAm促进hBMSCs成骨的调控机制,为rhAm临床应用提供理论依据.方法:经诱导表达并纯化得到25 kDa全长rhAm;利用乙酸法提纯猪EMPs,体外原代培养hBMSCs.采用实时定量PCR及Western印迹法检测不同时间点rhAm和EMPs作用hBMSCs后成骨因子(Runx2、ALP、COL-I)的变化,观察时效关系.采用碱性磷酸酶和茜素红染色检测2种蛋白对hBMSCs成骨矿化作用的影响.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:体外培养获得原代hBMSCs.实时定量PCR、Western印迹及细胞染色结果表明,10 μg/mL rhAm和200 μg/mL EMPs均可明显促进hBMSCs中成骨相关因子的基因及蛋白表达,且这种效果和蛋白作用时间有一定相关性.结论:rhAm与EMPs均能明显促进hBMSCs成骨,作用效果具有一定的时间依赖性.

  • 重组猪釉原蛋白对人牙龈上皮细胞生物学活性的影响

    作者:李希庭;束蓉;宋忠臣;周彦玢

    目的:探计重组25kDa猪釉原蛋白(recombinant porcine amelogenin,rPAm)对人牙龈上皮细胞(human gingival epitthelial cells,HGEC)黏附、增殖和迁移的影响.方法:采用不同浓度的rPAm(0、5、10、20μg/mL)刺激第2代HGEC,在相应的时间点,应用细胞计数法测定黏附和增殖的效果,以创面愈合模型测定细胞迁移效果,采用GraphPad Prisin软件对数据进行统计学分析.结果:在黏附实验中,rPAm对HGEC的黏附有抑制作用,且效果随着时间的递增和rPAm浓度的增高而加强;在增殖实验中,随着时间的递增和rPAm浓度的增高,HGEC增殖能力下降;在迁移实验中,rPAm能抑制HGEC迁移,20μg/mL效果好,24h后呈现剂量和时间依赖性.结论:rPAm能显著抑制人牙龈上皮细胞的黏附、增殖和迁移,存在剂量和时间依赖关系.

  • 体外培养人牙周牙髓相关细胞中釉原蛋白的表达

    作者:李希庭;束蓉;文海燕;程岚;蒋少云

    目的:观察釉原蛋白(amelogenin,Am)基因在体外培养的人牙龈上皮细胞及口腔外胚间充质来源细胞(人牙龈成纤维细胞、人牙周膜成纤维细胞和人牙髓细胞)中的表达.方法:采用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,检测培养细胞中釉原蛋白mRNA的表达.采用蛋白质免疫印迹技术检测培养细胞中釉原蛋白的表达.结果:培养的人牙周膜成纤维细胞、牙髓细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞中均未检测到釉原蛋白及其mRNA的表达.结论:体外培养的人牙周膜成纤维细胞、牙髓细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞不表达釉原蛋白基因.

  • 人釉原蛋白基因转染牙周膜细胞的实验研究

    作者:于光;束蓉;孙颖;程岚;宋忠臣;张秀丽

    目的:构建含有人釉原蛋白(human amelogenin,hAm)基因的慢病毒载体质粒,用重组慢病毒感染人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs),初步探讨釉原蛋白基因修饰种子细胞用于牙周组织工程修复的可行性.方法:采用RT-PCR方法获取hAm编码基因,构建慢病毒载体质粒FUAmW,重组质粒经双酶切及测序鉴定.聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法三质粒共转染293T细胞,获取重组慢病毒FUAmW FUGW,感染hPDLCs,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluoreseene protein,GFP)表达,流式细胞仪flow cvtometer,FCM)检测慢病毒载体转染效率.通过RT-PCR检测hPDLC中hAm基因的表达.结果:测序证实,RT-PCR产物序列与Genebank公布的Am编码序列一致,双酶切证实目的片段插入重组质粒.293T细胞及hPDLCs感染72h后.荧光显微镜下可见绿色荧光.FCM测得GFP感染2种细胞的阳性率分别为69.46%和33.99%.RT-PCR证实重组慢病毒FUAmW感染的细胞能表达hAm基因.结论:成功构建含有人釉原蛋白基因的慢病毒载体质粒,经293T细胞包装.得到重组慢病毒可感染牙周膜细胞.

  • 人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达

    作者:程岚;束蓉;宋忠臣;张秀丽;薛京伦;陈金中;田聆;黄璐

    目的:构建含人釉原蛋白(human Amelogenin,hAm)成熟肽编码区基因的慢病毒载体FuAmw,并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达.方法:以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板,采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区.将扩增产物与慢病毒载体转移质粒FUGW分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,构建重组慢病毒载体,转移质粒FUAmW,并进行酶切及测序鉴定.通过聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法将三质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒FUGW和FUAmW,然后分别离体感染293T细胞,培养 72h后,经荧光显微镜下观察和流式细胞计数检测感染效率,采用RT-RCR及Western印迹法检测釉原蛋白基因的表达.结果:重组质粒经测序证实.插入片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全一致.流式细胞仪测得重组病毒感染293T细胞绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的阳性率为67.38%.RT-RCR和Western印迹均证实,重组慢病毒FUAmW感染的293T细胞能够表达人釉原蛋白.结论:成功构建携带人釉原蛋白成熟肽基因的重组慢病毒载体质粒,以293T细胞包装得到的重组人釉原蛋白病毒能感染真核细胞并获得表达.

  • 釉原蛋白基因启动子的克隆及在不同细胞中转录调控的分析

    作者:朱庆林;吴补领;余擎;孔辉;郭婷;费俭;王铸钢

    目的:克隆釉原蛋白基因启动子及可能影响转录调控的序列,分析其在不同细胞中的转录模式.方法:检索并分析釉原蛋白基因的上游调控序列.利用PCR及酶切方法,从小鼠C57BL/6J基因组上扩增不同长度(包括基本启动子区域)的转录调控序列,与PGL3-Basic载体的虫荧光素酶基因连接.瞬时转染CHO、Hela、UMR-106细胞,检测荧光素酶的活性,分析不同长度的启动子片段在各种细胞中的转录活性.结果:共构建了6个不同长度的报告载体,瞬转后发现在Hela细胞中有较强的荧光素酶活性,在CHO、UMR-106细胞中活性很弱.在不同的细胞内,启动子活性随片段长度变化,其变化趋势有明显的相似性.表现为在转录起始点上游975bp与532bp的区域具有较强的转录活性,而转录起始点上游285bp区域的转录活性有所降低.结论:釉原蛋白的启动子可在Hela细胞中激活,Hela细胞可作为研究釉原蛋白启动子转录调控的细胞模型;初步判断釉原蛋白启动子上的-1693与-975之间的序列为转录抑制区域,-532与-285之间为转录增强区域.

  • 人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

    作者:程岚;雷建强;朱祺泉;王洪海;束蓉

    目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒.方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆.结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同.结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒.

  • 成釉细胞的研究进展

    作者:江中明;吕春堂;周中华

    成釉细胞是牙器官形成的关键细胞,国内外已成功离体培养出成釉细胞,成釉细胞合成和分泌的细胞外基质--釉原蛋白在釉质的形成中起着关键作用.成釉细胞的增殖和分化受到多种因素的调控.本文就成釉细胞的离体培养、釉原蛋白的研究及影响成釉细胞增殖和分化的因素作一综述.

  • 人釉原蛋白基因转导对人骨髓基质细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

    作者:胡景超;束蓉;宋忠臣;程岚

    目的 观察慢病毒介导的人釉原蛋白(hAm)基因转导对人骨髓基质细胞(hBMSCs)增殖及细胞成骨分化标志物碱性磷酸酶(ALP)合成的影响.方法 采用RT-PCR技术获取hAm编码基因,扩增产物与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体质粒(FUGW)连接构建重组慢病毒载体质粒FUAmW,以聚乙烯亚胺(PEI)法三质粒共转染293T细胞组装获取慢病毒,并感染hBMSCs(目的基因转导组);以感染FUGW和未感染病毒的hBMSCs分别作为对照基因转导组和空白对照组.流式细胞仪测定慢病毒感染效率,RT-PCR鉴定细胞hAm表达;MTT比色法检测细胞增殖;慢病毒感染后第7天,倒置相差显微镜观察各组细胞ALP染色情况;感染后第4、7、10天,采用RT-PCR技术检测各组hBMSCs内ALP mRNA表达.结果 目的基因转导组细胞FUAmW的感染效率达40.29%,RT-PCR检测到540 bp的目的基因产物条带;细胞增殖水平显著高于对照基因转导组和空白对照组(P<0.05);慢病毒感染后第7天,目的基因转导组ALP染色阳性细胞数量明显少于对照基因转导组和空白对照组;感染后第4、7、10天,目的基因转导组细胞ALP mRNA表达显著低于对照基因转导组和空白对照组.结论 导入外源性Am基因能刺激hBMSCs增殖,但细胞内ALP mRNA表达下调.

  • 抗人釉原蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

    作者:程岚;束蓉;夏一如;宁航

    目的:制备针对人釉原蛋白的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定.方法:用原核表达系统表达纯化的重组人全长釉原蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,采用有限稀释法和间接酶联免疫吸附测定法筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠体内诱导制备腹水,通过饱和硫酸铵沉淀法和蛋白G亲和层析柱纯化抗体.结果:筛选到3株能稳定分泌抗人釉原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为H10G1、H3G1、G5H3.腹水单克隆抗体效价分别为1:243000、1:729000、1:729000,纯化后单克隆抗体效价为1:81000、1:243000、1:729000.3株单克隆抗体抗原表位分析显示均识别人釉原蛋白45~149位的氨基酸序列.结论:成功制备出针对人釉原蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究探讨釉原蛋白在牙根发育及牙周再生中的功能奠定了基础.

  • 釉质仿生矿化模型的研究

    作者:罗菁菁;宁天云;李全利;许亮

    目的:构建釉质生物矿化的模型,包括有机基质模板(类釉原蛋白寡肽序列)的建立和无机离子供体(包裹钙磷离子的温度敏感性脂质体)的合成,体外实现类釉质样结构的再矿化。方法:首先通过标准固相法合成所需“类釉原蛋白”寡肽[(Gln?Pro?Ala)4?Thr?Lys?Arg?Glu?Glu?Val?Asp],并用CaCl2溶液诱导其进行自组装;其次采用二棕榈酰磷脂酰胆碱和二肉豆蔻卵磷脂为原料,通过相交融合法分别合成包裹钙、磷离子的温度敏感性脂质体;后在37℃时,将酸蚀后的牙片浸泡在包裹钙、磷离子的脂质体与寡肽的混悬液中,作为实验组。将酸蚀后的牙片浸泡在包裹钙磷离子的脂质体混悬液中,作为对照组,促进脱矿后的釉质再矿化。矿化后的牙片通过扫描电镜( SEM)、傅立叶变换红外光谱仪( FTIR)和X射线衍射仪( XRD)进行表征。结果:实验组的脱矿釉质表面均匀有序的沉积了一层釉质样的羟基磷灰石晶体( HA)结构,而对照组只沉积了较少量无序的HA晶体。结论:通过类釉原蛋白寡肽有机矿化模板的建立,以及仿生釉质矿化过程中钙、磷离子的输送,构建了釉质仿生矿化模型,并实现了脱矿釉质表面类釉质样微结构的再生。

  • 一种釉质特异性生物矿化模板的构建

    作者:许小会;宁天云;杨聪翀;朱丽芳;徐晓华;祝小鹏;李全利;刘来奎

    目的 构建一种自组装类釉原蛋白两亲性寡肽,作为釉质仿生矿化的有机模板.方法 依据釉原蛋白分子在釉质形成中自组装成“纳米球”超分子结构的机制,参照目前“自组装多肽类生物材料”的设计特点,通过对釉原蛋白分子功能性残基进行改性,构建“类釉原蛋白两亲性寡肽”生物矿化模板,采用固相合成法合成并纯化,经质谱仪、高效液相色谱仪等鉴定.在寡肽溶液中加入1 mol/L的CaCl2溶液观察其能否自组装;将组装后的寡肽涂于透射电镜的铜网上,用2.5%的戊二醛固定1h后先置于常温或40℃下10 mmol/L的CaCl2溶液中1h,去离子水漂洗后再置于5 mmol/L的Na2HPO4溶液中1h,5个循环后取出自然干燥,通过扫描电镜( SEM),透射电镜(TEM)及选区电子衍射(SAEDS)观察表征.结果 类釉原蛋白两亲性寡肽序列为C18H35O- Thr - Lys - Arg - Glu - Glu - Val - Asp,高效液相色谱仪(HPLC)示多肽纯度为98.29%,质谱仪(MS)示肽的分子质量为1 142.41 u.通过Ca2+可使其自组装为纳米纤维超微结构的凝胶态.通过交替矿化发现组装后的类釉原蛋白两亲性寡肽能摄取溶液中的钙磷离子,在寡肽纳米纤维表面成核矿化,形成磷灰石晶体.结论 成功构建了一种类釉原蛋白两亲性寡肽,可以作为釉质仿生的特异性生物矿化模板,用于诱导釉质再矿化研究.

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