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艰难梭菌细胞毒素B功能区的原核表达及免疫原性
目的 纯化已表达艰难梭菌(CD)细胞毒素B羧基末端受体结合区(CD3)的基因,并检测其免疫原性.方法 PCR克隆目的基因到表达载体pET22b(+),重组质粒转化到E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,利用金属螯合色谱层析方法纯化后,SDS-PAGE方法对纯化蛋白进行分析.并检测其免疫反应性.结果 成功表达的是分子质量约为71.3 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的34%,可溶性表达占上清的22.7%,包涵体占沉淀的25.7%.重组蛋白纯化后可溶性蛋白浓度为0.781 g/L.并与抗毒素B抗体具有良好的免疫原性.结论 成功克隆了CD3基因,构建的重组质粒可高效表达CD3重组蛋白,为CD相关性疾病的诊断及后期制备疫苗,提供了有力的保障.
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应用pET32a(+)载体表达尘螨变应原Der f 3及其产物IgE反应性鉴定
目的 获得粉尘螨变应原第3组分Der f 3原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE反应性. 方法 酶切质粒pET28a(+)-Der f 3获得目的基因Der f 3,将其与pET32a载体连接成质粒pET32 a (+)-Der f3,转化BL21细菌,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot和质谱鉴定纯化产物.以纯化产物为包被抗原,采用间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况. 结果 成功构建了原核表达质粒pET32 a(+)-Der f 3.将该质粒转化E.coli BL21诱导表达,亲和层析纯化后经SDS-PAGE鉴定获得目的蛋白,Western blot验证该蛋白的能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其结构与天然Der f 3一致.以此产物为包被抗原采用间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为29.73％ (11/37). 结论 成功构建了原核表达质粒pET32 a (+)-Der f 3,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性.
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重组釉原蛋白的提取和纯化
目的:通过固相化金属亲和层析的方法,获得较高纯度的具有生物活性的重组釉原蛋白.方法:将重组表达质粒pcDNA3.1TM/Am/myc-His(-)B转染至HEK 293A细胞中,用G418持续筛选,培养扩增.收集细胞,加入RIPA细胞裂解液,粗提蛋白.通过镍金属蟹合层析的方法,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot检测,检测蛋白纯化程度和产率.将釉原蛋白冻干,-80℃冻存.结果:SDS-PAGE及Western Blot检测结果表明,蛋白粗提液中有大小约50KDa的重组釉原蛋白表达,经过HisTrapHP column层析,目的蛋白形成了单一条带,纯化率为91.3%.结论:本实验通过固相化金属亲和层析的方法,获得了高纯度的重组釉原蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.
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脂肪酸合成酶的纯化
目的:分离纯化SD大鼠肝脏脂肪酸合成酶并对其进行鉴定.方法:通过低脂高糖饮食诱导SD大鼠肝脏的脂肪酸合成酶高表达,经过聚乙二醇分级沉淀、DEAE Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-300 High Resolution凝胶层析纯化脂肪酸合成酶,并采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色进行鉴定,用Folin-酚法测定蛋白含量,用紫外分光光度法测定其体外活性.结果与结论:纯化所得脂肪酸合成酶的比活为1.6 U/mg,活性得率为38%,相对分子质量约为260×103 .为脂肪酸合成酶抑制剂的筛选和进一步的研究打下了坚实的基础.
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蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化
目的：通过基因工程手段实现牵引丝关键组成蛋白MaSp1在大肠杆菌中的异源表达，并对其进行分离纯化，从而建立基因工程蜘蛛丝基因序列串联拼接、载体构建以及原核表达与纯化的关键技术体系。方法利用同尾酶连接法对合成的基因工程蜘蛛丝基因单体序列进行串联拼接，获得多倍串联体克隆重组子，将鉴定正确的多倍串联体克隆重组子与原核表达载体pET28a（＋）连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导其表达，表达产物通过SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定。在此基础上对工程菌进行高密度发酵，所获蛋白通过硫酸铵分级分离方法进行纯化。结果与结论成功构建了基因工程蜘蛛丝MaSp1多串联体的表达载体，原核表达蛋白的相对分子质量与预期一致，且纯化的目的蛋白纯度达80％以上。上述研究工作为开展基因工程蜘蛛丝蛋白的规模化制备建立了关键技术方法，并为后续基因工程蜘蛛丝的人工纺丝提供必要的前提和工作基础。
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免疫单扩散法测定重组铜绿假单胞菌外毒素A蛋白含量方法的建立及其应用
目的:探索建立免疫单扩散法测定不同料液中重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,rEPA)蛋白含量新方法.方法:对缓冲液系统、佳抗体浓度和佳观测时间等关键因素进行摸索,确定方法的佳条件.在此基础上,对该方法的专属性、精密度、准确性和标准曲线的可靠性进行验证,并将该方法应用于rEPA柱层析纯化中不同样品目标蛋白含量的测定及回收率计算.结果:佳缓冲系统为0.85％ NaCl溶液,佳抗体用量为50 μL·mL-1,佳观测计算时间为4h.方法具有较好的专属性、精密度、准确性和线性.结论:初步建立了免疫单扩散试验测定不同料液中rEPA蛋白含量新方法,为其纯化工艺的优化奠定了基础.
关键词： 免疫单扩散法 方法验证 重组铜绿假单胞菌外毒素A 蛋白质纯化 收率 -
鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定
目的 建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法.方法 通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化.超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白.通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定.结果 本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯.与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异.研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05 mol/L醋酸溶液.结论 为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础.
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腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶的表达、纯化及晶体分析
目的 纯化腾冲嗜热厌氧菌新型变旋酶TTE1925,用于晶体生长和三维结构分析.方法 将tte 1925基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,将菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒转化E. coli BL 21(DE 3)后获得表达菌株.该菌株经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导高效表达出带有谷胱甘肽S转移酶标签的可溶性融合蛋白,经过Glutathione Sepharose~(TM)4B亲和层析、Resource Q 6mL离子交换层析和10/300 superdex 200分子筛层析纯化后,得到目的 蛋白TTE1925.结果 纯化后蛋白的纯度达到99%以上.蛋白采用悬滴气相扩散法得到衍射至1.9(A)的棒状晶体.结论 成功制备了高纯度TTE1925蛋白,获得TTE1925蛋白质晶体,为进一步解析变旋酶的三维结构及其生物学功能分子机制研究奠定了基础.
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小鼠肺腺癌热休克蛋白70-抗原肽复合物的纯化
目的探索肿瘤热休克蛋白70抗原肽复合物(HCA70)分离、纯化的方法.方法采用低渗、反复冻融匀浆、ADP-Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析,从体外培养的小鼠肺腺癌细胞(LA-795)中纯化HAC70;通过SDS-PAGE电泳、Western blot检测、小鼠移植瘤动物实验证实所获得蛋白是否为HAC70.结果获得蛋白分子量为70kD左右,与抗HSP70特异单抗结合,用此蛋白主动免疫的小鼠可抵抗LA795细胞的攻击,获得了高纯度的HAC70.结论采用ADP-Agarose亲和层析结合DEAE离子交换层析可获得高纯度的HAC70.
关键词： 热休克蛋白70 热休克蛋白70-抗原肽复合物 蛋白质纯化 主动特异免疫 -
TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化
目的:克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段.方法:抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定.将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Westem-blot鉴定纯化产物.结果:抗CD3 McAb能诱导正常人外周血单个核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达带.Kodak软件分析表面GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8 mg纯度的95%以上的GST-Tex.Western-blot结果证实54KD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应.结论:成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.
关键词： TNF相关的凋亡诱导配体 基因克隆 基因表达 蛋白质纯化 -
尘螨变应原Derf 6/pET32a（+）重组质粒构建、表达、纯化及其产物血清IgE结合率
目的：：获得尘螨变应原第6组分Der f 6原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE结合率。方法：酶切质粒pET28a(+)-Der f 6获得目的基因Der f 6,将其与pET32a(+)载体连接成质粒pET32a (+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)、免疫印迹实验( Western blot)和蛋白质串联质谱( MALDI-TOF/TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果：成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f 6,将该质粒转化E. coli BL21诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示获得目的蛋白,Western blot验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3%(19/46)。结论：成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。
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HSP70-肿瘤肽的纯化及其抗肿瘤免疫效应
目的:探索热休克蛋白70(HSP70)-肿瘤肽分离、纯化方法,并观察其抗肿瘤免疫保护效应.方法:采用低渗匀浆、超速离心、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-Agarose亲和层析和DEAE离子交换的亲和层析,从热处理的小鼠肝癌(HCaF)细胞中分离、纯化HSP70-肿瘤肽,并通过主动免疫保护试验观察其抗肿瘤免疫效应.结果:蛋白得率为每g湿重瘤细胞可纯化50～100 μg HSP70-肿瘤肽;经SDS-PAGE和Western blot检测,纯化的HSP70-肿瘤肽具有很高的纯度和特异性;HSP70-肿瘤肽主动免疫的小鼠可抵抗HCaF细胞的攻击,存活率达75%.结论:采用低压亲和层析可获得高纯度的HSP70-肿瘤肽,且可诱导明显的抗肿瘤免疫保护效应.
关键词： 热休克蛋白70-肿瘤肽 蛋白质纯化 主动免疫 -
HSP70多肽复合物修饰树突细胞抗胰腺癌研究
目的:研究肿瘤热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物修饰树突状细胞激活淋巴细胞治疗胰腺癌的策略和方法.方法:采用低渗裂解,ConA-Sepharose亲和层析柱及ADP-Agarose亲和层析柱,从小鼠胰腺癌(MPC83)瘤块中纯化HSP70多肽复合物;纯化出的70KD蛋白修饰小鼠骨髓来源诱导树突细胞(DC)并制备树突细胞HSP70多肽肿瘤疫苗,MTT法检测修饰后DC增殖活性;用修饰后DC激活小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测激活淋巴细胞在不同效靶比下对MPC83的体外杀伤活性.结果:获得较高纯度分子量为70 kD左右的蛋白质;50～100ng HSP70多肽复合物可修饰104树突细胞,每克瘤块能获取HSP70多肽复合物约100μg;来自MPC83细胞瘤块HSP70多肽复合物激活的淋巴细胞能特异性杀伤MPC83细胞.结论:采用低压亲和层析柱可从胰腺癌瘤块中获得较高纯度HSP70多肽复合物,HSP多肽复合物DC疫苗用于胰腺癌细胞免疫治疗能获得体外杀伤效果,为临床胰腺癌生物免疫治疗奠定基础.
关键词： 胰腺癌 热休克蛋白70多肽复合物 蛋白质纯化 树突状细胞 -
rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化
目的:构建人肿瘤坏死因子样分子1A(TL1A)原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白.方法:人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15[pREP4].IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)纯化靶蛋白.结果:目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15[pREP4]经IPTG诱导表达相对分子质量约22000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合.结论:成功地构建了重组原核表达质粒pQE-TL1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白.
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Vsig4和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化
目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白IgG3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用.方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠IgG3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞.Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力.结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系.经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合.结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础.
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日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价
目的将亚克隆入pET32a(+)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)基因进行表达及蛋白纯化,并对表达产物的免疫反应性进行评价.方法将重组表达质粒pET32a(+)-AK转入宿主菌大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后超声裂菌,离心,取上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);将SDS-PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6 wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验(Western blotting);用金属Ni螯合物亲和层析树脂(Ni-NTA)层析柱纯化目标蛋白;以纯化后的融合蛋白为包被抗原,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清.结果重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE,于相对分子质量(Mr)40 000处见一特异表达带,与预期表达的融合蛋白大小相符;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的6-His基团,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清.结论AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达,该重组蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有特异的免疫反应性.
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人抵抗素基因克隆和蛋白纯化
从人脂肪组织用RT-PCR扩增抵抗素基因cDNA并测序,PCR产物亚克隆到T载体,再克隆到原核表达载体,表达质粒转化大肠杆菌并诱导表达,以Glutathin-Sephrose 4B亲和层析柱纯化了目的融合蛋白.
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人精浆中与精子前向运动相关蛋白的研究--蛋白的纯化及活性分析
目的进一步纯化人精浆中与精子前向运动相关的蛋白并进行活性鉴定.方法运用ConA包被珠的蛋白质亲和层析技术及超滤技术对热处理后的人精浆进行蛋白分离,随后对获得的层析洗脱液经浓缩后进行聚丙酰胺凝胶电泳及Commassie Blue R-250染色,根据染色部位将电泳凝胶切割成5部分并获得各部分的蛋白浸出液.结果含第2和第3部分蛋白浸出液的实验组与公牛附睾头部精子及茶碱共同孵育后,与仅用茶碱的对照组相比,前者的精子前向运动值显著高于后者(P＜0.01).聚丙酰胺凝胶电泳及银染色分析显示,第2和第3部分蛋白的分子量分别介于85.0～135.0kDa及44.1～85.0 kDa之间;而SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析却发现:第2部分蛋白解离成分子量分别为89,74,18,16 kDa的条带痕迹,第3部分蛋白则解离成46.8和57.5k Da的亚基.结论人精浆中与精子前向运动相关蛋白的纯化及活性分析可能对了解该蛋白的结构和功能具有重要的意义.
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中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶表达、纯化及活性特征
目的:将编码青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)的基因克隆于原核表达载体,并通过表达获得重组的TPx蛋白.方法:将已获得的TPx cDNA片段克隆于原核表达载体pET-32a(+)M,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组表达质粒pET-32a(+)M-TPx.37℃下经IPTG诱导,该融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.获得的重组TPx蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白.并对重组蛋白进行活性鉴定和结构分析. 结果:构建的重组质粒pET-32a(+)M-TPx在大肠杆菌中高效表达,经纯化后的重组TPx蛋白纯度可达90%以上,其单体相对分子质量为24 460.重组TPx蛋白是以同源二聚体和单体混合的形式存在,在二硫苏糖醇(DTT)存在时具有还原H2O2活性和对超螺旋DNA或对硫醇基敏感蛋白的保护作用. 结论:本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了重组TPx蛋白,并且证实其活性与其高级结构紧密相关.
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禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究
目的 设计并获得一种安全、高效,并能对以H5N1亚型为主的多种禽流感病毒亚型产生保护的复合基因工程疫苗.方法 利用分子生物学和分子免疫学方法对国内以及周边国家流行的禽流感毒株进行全面分析,利用生物信息学技术合理设计亚单位加表位的全新复合结构疫苗的氨基酸序列；利用大肠杆菌密码子优化技术根据疫苗氨基酸序列获得基因序列；通过全基因合成的方法获得该疫苗的基因,并通过大肠杆菌表达系统对该疫苗进行表达；目的蛋白经过包涵体洗涤和色谱纯化后复性；通过ELISA评价其抗原特异性,并乳化制备成禽流感蛋白疫苗,通过小鼠体内免疫试验检测其免疫效力.结果 设计了包含通用性的辅助性T细胞表位、B细胞表位以及CTL表位的串接疫苗结构；全基因合成获得了该复合疫苗的基因序列；该基因在大肠杆菌表达系统中得到了高效表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白30％；经过粗纯和精纯后的目的蛋白纯度达到95.5％,复性后获得可溶性蛋白溶液,浓度可达2.4 mg/mL.结论 通过小鼠实验,验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫.小鼠免疫试验证明,该疫苗可以在小鼠体内有效诱发免疫应答.
