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多位点序列分型及其应用
多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法.这种方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列,分析菌株的变异.MIST操作简单,结果能快速得到并且便于不同实验室的比较,已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究.随着测序速度的加快和成本的降低,以及分析软件的发展.MLST逐渐成为细菌的常规分型方法.
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肠炎沙门菌多位点序列分型技术的研究
目的 研究肠炎沙门菌菌株间的分子特征,建立了分子流行病学研究方法--多位点基因序列分型技术(MIST),并对食品中的肠炎沙门菌分离株进行分型研究.方法 选择肠炎沙门菌的6个管家基因thrA、purE、sucA、aroC、heroD、dnaN及一个特异性的DNA标记sdfI作为目标基因.对上述基因分别进行PCR扩增及产物测序,用sequencer2.0软件对测序结果进行分析、比对核苷酸的差异.同时,将肠炎沙门菌株与GenBank中鼠伤寒沙门菌LT2相应的基因序列进行比较.结果 在肠炎沙门菌标准菌株50041和18株食品分离株之间,6个基因PER产物范围内的近60000个核苷酸序列完全相同,未观察到同一血清型内的基因突变.而与LT2相比,基因产物发生了1到6个点突变.在对SdfI的核苷酸序列比较研究中发现,肠炎沙门菌标准菌株与食品中分离株SdfI的核苷酸序列与GenBank中该序列的碱基对比,发生了C182T的点突变.即MLST技术揭示了在同一血清型内各菌株管家基因碱基序列的高度保守.结论 MLST方法适用于不同血清型沙门菌株间的分型研究,而不适于同一血清型的菌株分型.
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冠心病相关基因表达分析中管家基因表达水平比较
比较β-肌动蛋白(β-actin)、信号识别颗粒14(SRP14)和18S-rRNA等3个管家基因在冠心病(CAD)患者和健康对照人群中的表达差异.提取外周血RNA,经逆转录和聚合酶链反应,应用荧光标记技术及GenomeLab GeXP基因表达分析系统检测3个管家基因的表达水平.结果发现3个管家基因在对照组和CAD组中β-actin表达的差异小,SRP14次之,18S-rRNA的表达差异较大,提示管家基因β-actin和SRP14可作为检测CAD相关基因表达水平的内部参考基因.
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老年大鼠组织mRNA分析中内参基因的选择
目的 探讨用于老年大鼠组织基因mRNA表达分析的内参基因选择.方法 用实时反转录PCR技术评价5个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3pd)、β-肌动蛋白(ACTB)、H3组氨酸3B(H3f3b)、酸性核糖体磷蛋白P0(Arbp)和18S核糖体RNA(18S)的表达水平.结果 老年大鼠肾组织中表达稳定的是管家基因ACTB,心脏和肺组织中表达稳定的是G3pa;而Arbp在不同组织之间的表达差异小.结论 老年大鼠组织间基因表达mRNA分析应使用至少两个参照基因:一个是核糖体基因18S,另一个适合的内参基因是Arbp.
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棒状乳杆菌4个管家基因PCR引物的设计与验证
目的 探索一种为棒状乳杆菌管家基因设计PCR引物的方法,并验证所设计引物的PCR扩增效率和特异性.方法 先用在线引物设计工具Primer-BLAST为棒状乳杆4个菌管家基因设计PCR引物.然后用软件oligo 6.44评价引物的各项参数,综合考虑PCR引物设计的各项原则,人工筛选出佳引物,后通过PCR扩增验证引物的效率和特异性.结果 每个管家基因用Primer-BLAST程序设计得到10对引物,后各选出1对引物.经PCR扩增验证,这些引物不仅效率高,而且特异性好.结论 本研究所用的引物设计方法简单实用,用于设计棒状乳杆菌管家基因PCR引物效果理想.
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如何利用geNorm软件筛选基因表达测定的内参基因?
答:随着实时荧光定量PCR成为检测基因表达谱的高通量、高精度的方法,基因表达分析在生物学研究中得到广泛应用.采用稳定的内参基因对反应进行标准化可以增加该方法的敏感度、重复性和动态范围,理想的内参基因在所研究的组织、细胞和实验条件下均恒定表达.管家基因是维持细胞低限度功能不可少的基因,在所有类型细胞中都表达,是广泛应用的内参基因.但是,很多研究表明管家基因在不同组织、细胞以及不同条件下表达量并非永远恒定,甚至差别很大,至今尚未发现在所有条件下均恒定表达的管家基因.因此,对特定基因表达研究中候选管家基因的表达稳定性进行评价,筛选出为稳定的管家基因作为内参基因,对保证研究结果的真实、可靠至关重要.
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NSAIDs及选择性COX-2抑制剂对骨、肌腱、韧带愈合影响的研究进展
非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs, NSAIDs)可通过降低环氧合酶活性抑制前列腺素(prostaglandin,PGs)的合成,从而降低组织的炎症反应程度,并减轻患者的疼痛反应。其中,环氧合酶是催化花生四烯酸转换为PGs和相关化合物的限速酶。目前已知的环氧合酶有3种：COX-1、COX-2、COX-3。其中,COX-1属于“管家基因”,可在全身大部分组织中持续表达,调节生理性 PGs的合成；COX-2是“诱导型基因”,在人体大部分组织中为诱导性表达,常在炎症、创伤及疼痛情况下由促炎性因子诱导表达；而COX-3则是近年在狗和大鼠实验中发现,可能与吲哚美辛诱导的低温麻醉及痛觉缺失有关的一种COX的新亚型[1-2]。
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褪色沙雷菌耐药率与多位点序列分析研究
目的：研究褪色沙雷菌的耐药率与分子流行病学规律，建立多位点序列分析方法，明确其进化特征，为临床针对性使用抗菌药物和防控此致病菌感染提供依据。方法对2013年9月－2014年12月分离的40株褪色沙雷菌进行体外药物敏感性试验与多位点序列分析（MLSA），并用Splits tree与CLUSTALW软件进行生物信息学分析，揭示其流行趋势。结果体外药敏试验结果表明，40株褪色沙雷菌对13种抗菌药物的耐药率在10．0％～52．5％，对亚胺培南耐药率为32．5％；M LSA设计4个管家基因，GC含量约为60．0％；各等位基因数分布于14～16，各多态性位点数分布于33～74，gyrB的多态性位点数多（74个）；Splits tree软件分裂分解分析结果显示，大部分褪色沙雷菌聚在一起，形成一个克隆复合体；CLUSTALW软件聚类分析结果显示，40株褪色沙雷菌形成19个ST型，其中ST8型12株，且ST8型是耐碳青霉烯类抗菌药物褪色沙雷菌的流行与暴发型， ST8、ST9、ST10与ST11形成一个克隆复合体CC8。结论褪色沙雷菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药率较高，且多为泛耐药菌株；褪色沙雷菌的分子流行病学趋势相对较慢，在基因组上高度保守，目前需要重点监测以ST8型为代表褪色沙雷菌CC8克隆复合体的流行，以防其在医院的大规模流行与暴发。
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鲍氏不动杆菌耐药率与多位点序列分型研究
目的 研究鲍氏不动杆菌的耐药率与分子流行病学规律,明确其进化特征,为临床抗菌药物的应用提供依据.方法 2010年5月-2012年9月对187株鲍氏不动杆菌开展体外药物敏感性试验与多位点序列分型(MLST)研究.结果 MLST方案中选取的7个管家基因GC含量分布约40.00％;各等位基因数分布于1～8,gltA、gyrB的等位基因数只有1个,gpi的等位基因数有8个;rpoD、gpi的多态性位点多,分别为7个与9个;体外药物敏感性结果表明,187株鲍氏不动杆菌对8种抗菌药物的耐药率分布于23.6％～53.2％;MLST结果显示,所有菌株共形成4个已知ST型,其中ST92有83株、ST75有57株、ST90有38株、ST137有8株,并发现1株新ST型;上述5个ST型均属于克隆复合体CC92.结论 鲍氏不动杆菌对临床常用抗菌药物的耐药率较高,呈多药耐药趋势;鲍氏不动杆菌的分子流行病学趋势相对比较集中,其进化速度较慢,目前需要重点监控以CC92为代表的鲍氏不动杆菌的流行情况,以防其在医院的大规模暴发与流行.
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克雷伯菌属基于管家基因及水平转移基因的菌株亲缘性分析
目的 对多药耐药克雷伯菌属进行基于管家基因与水平转移基因的菌株亲缘性分析,有助于医院感染的监测.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法对20株多药耐药克雷伯菌属分别检测与耐药相关的管家基因和水平转移基因,并对检测结果进行样本聚类分析.结果 20株克雷伯菌属中2株植生克雷伯菌与18株肺炎克雷伯菌处在两个不同的簇群中,18株肺炎克雷伯菌可分为A与B两个簇群,10、12、15、17、18号株及6、8、20号菌株分别为同一克隆菌株.结论 耐药基因的样本聚类分析可识别出具有相同耐药特征的菌株,具有一定的流行病学意义,为追溯耐药菌传播途径提供方便.
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变形链球菌recA基因启动子荧光蛋白表达载体的构建
目的 构建由recA基因启动子启动的红色荧光蛋白穿梭表达载体,研究变形链球菌recA基因表达的特点,以期为不同致龋环境中变形链球菌致龋毒力因子基因的表达提供参照.方法 以变形链球菌(UA159)基因组DNA为模板,扩增recA基因启动子,采用双酶切反应连接入载体pDsRed2-N1,构建原核表达载体pRred;通过酶切重组人穿梭载体pDL276,构建红色荧光蛋白表达载体pLRred.结果 经酶切鉴定目的质粒片段插入无误,同时重组载体pLRred转化菌荧光观测结果提示,重组载体pLRred构建成功.结论 本项研究中构建的recA基因启动子红色荧光蛋白同源重组克隆载体正确,可应用于recA基因表达的研究,同时可为研究变形链球菌致龋基因的表达提供内参照.
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人类管家基因和非管家基因microRNA绑定密度的比较及与3′UTR进化保守性关系的分析
目的：该研究从整体水平比较microRNA（miRNA）对管家基因和非管家基因的调控差异并研究3′UTR的进化保守性与miRNA对两类基因调控差异之间的相关性。方法通过对3个基于序列的miRNA靶基因预测软件整合分析，并结合基于miRNA-靶基因的表达谱数据相关性分析，以获得miRNA对两类基因的调控情况，同时利用phastCons保守性分值对两类基因的3′UTR区域进行多物种进化分析。结果研究发现miRNA在管家基因的3′UTR上有显著地高密度绑定，管家基因的3′UTR区域具有相对较高的序列保守性。结论该研究结果突出了miRNA对管家基因表达调控的重要作用，对于重新理解miRNA对真核生物基因表达调控作用具有一定的参考价值。
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浅低温体外循环手术前后基因表达研究中内参基因的选择
目的 筛选浅低温体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)手术前后基因表达变化研究的内参基因.方法 通过阅读文献选择基因表达研究中常用的11个管家基因(housekeeping genes,HKGe),采用Beacon Designer软件设计PCR引物;收集4例浅低温CPB辅助手术患者CPB前、体温低点、CPB末以及术后1d、3d、7d的静脉血24份,提取总RNA,采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR法检测各样品中11个HKGe的循环阚值;对所得循环阈值进行转换,采用geNonn程序对候选基因的表达稳定性和所需内参基因数量进行分析.结果 11个HKGs稳定性排序为:UBC
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多位点序列分析在空肠弯曲菌监测中的运用
目的 探讨多位点序列分析技术在腹泻病原空肠弯曲菌分子溯源方面的运用.方法 用多位点序列分析(MLST)对上海市浦东新区腹泻病原监测中的70株阳性空肠弯曲菌菌株的7个管家基因进行扩增、测序并上传至MLST数据库确定基因序列型(ST型),并运用BioNumerics 7.1构建遗传进化树和聚类图进行亲缘性分析.结果 70株空肠弯曲菌分为52种已知ST型,分属13个同源谱系,ST353同源复合体占了流行株的26％.从70株分型结果中能找到聚集性病例.结论 运用MLST技术能在分子水平上对空肠弯曲菌进行分型,并能直观表现菌株间的相互关系,从散发病例中找到聚集特征,为疾病的控制提供依据.
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大鼠心肌梗死模型中管家基因的选择
目的 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)广泛应用于基因表达分析,其中选择合适的管家基因非常重要.大鼠心肌梗死模型是心肌梗死相关研究的主要动物模型,而心肌梗死后大鼠管家基因选择问题研究报道则较少.本研究拟探讨大鼠心梗模型中管家基因表达的稳定性.方法 结扎冠脉前降支制作心梗模型,分析并挑选出使用广泛的4个标准管家基因:3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),核糖体蛋白L13A(RPL 13A),β-肌动蛋白(ACTB),结合区连接蛋白(ARBP);用实时荧光反转录-聚合酶链反应方法比较它们在心梗大鼠心脏中的表达,采用GeNorm程序分析适于心肌梗死后大鼠基因表达管家基因研究.结果 RPL13A、GAPDH、ARBP及ACTB基因表达稳定度的平均值(M值)分别为0.812、0.721、0.812和1.2.结论 GAPDH及ARBP是大鼠心梗模型中表达稳定的基因.
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霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析
目的分析广东霍乱弧菌(VC)代表菌株主要毒力基因和管家基因序列.方法 PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因(ctxAB和tcpA)和管家基因(dnaE、hlyA、mdh和recA)、基因测序、对序列进行生物信息学分析.结果不同年代分离的2株埃尔托型(EVC)产毒株和1株O139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较,ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99.7%～100%和98.8%～100%,ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98.8%～100%和96.8%～100%,tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100%同源.3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99.8%～100%,100%,99.5%～99.8%和100%,氨基酸序列同源性分别为100%,100%,98.5%～99.3%和100%;3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97.0%～97.2%,91.8%,94.1%～94.4%,96.9%,氨基酸序列同源性分别为100%,94.6%,94.3%～98.5%和99.7%.结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切,而与O139群VC非产毒株较远,O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株.
关键词： 霍乱弧菌 霍乱肠毒素基因 毒力协同调节菌毛A亚单位基因 管家基因 序列分析 -
荧光定量聚合酶链反应法比较标准管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠不同组织中的表达
背景:反转录聚合酶链反应用于基因表达分析越来越显示出其重要性,其中合适的内参基因选择很重要,目前并没有适合于所有体系可作为内参的管家基因.人鼠是常用动物模型,选择合适的大鼠管家基因作为内参尤其必要.目的:比较分析使用广泛的4个标准管家摹因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA在老年大鼠肝、肾、心、肺组织和大脑皮质中的表达情况.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-07/08在泰山医学院生命科学研究所分子生物学实验室及泰安市疾控中心病毒检测中心实验室完成.材料:选用老年SD大鼠3只,用于检测管家基因表达情况.方法:采用反转录实时荧光聚合酶链反应技术检测老年大鼠肝、肾,心、肺组织和大脑皮质中有着不同表达丰度和功能的4个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、酸性核糖体磷蛋白P0及18S核糖体RNA的表达情况.主要观察指标:老年大鼠不同组织内4个管家基因的表达水平及不同组织间的表达差异.结果:①酸性核糖体磷蛋白P0在老年大鼠不同组织间表达差异小.②老年大鼠肾组织中表达稳定的管家基因是β-肌动蛋白:心脏组织和肺组织中表达稳定的管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶.结论:老年大鼠组织间信使RNA分析仅用1个内参基因是不合适的,至少应该使用两个参照基因,1个选用18S核糖体RNA:另一个基因的选择标准如下:适用于分析不同组织间基因表达情况的内参基因是酸性核糖体磷蛋白P0,而心脏和肺组织研究适用3-磷酸廿油醛脱氢酶,肾组织研究适用β-肌动蛋白.
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海南岛光滑假丝酵母菌多位点序列分型研究
目的:对海南省光滑假丝酵母菌临床分离株进行基因分型研究,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系.方法:采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术,对临床分离的25株光滑假丝酵母菌6个管家基因序列进行测定；并将各个基因的序列与MLST数据库中储存的序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(STs).结果:25株临床分离的光滑假丝酵母菌通过MLST产生ST7、ST19、ST15、ST26、ST45共5个不同的序列型,其中ST7为主要序列型.结论:海南省光滑假丝酵母菌感染型别丰富,具有多样性；MLST分型具有较高的分辨力,可用于流行病学和菌群多态性的研究.
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Barrett食管中环氧合酶-2表达和逆转的研究进展
Barrett食管(Barrett's esophagus)是指食管下段的正常鳞状上皮被一种特殊肠化生的柱状上皮所取代的病理现象.传统Barrett食管定义中这种黏膜化生必须达到或超过3 cm,而目前认为食管黏膜发生任何长度的肠化生均可定义为Barrett食管.这种特殊的肠化生可以一定模式(肠化生-不典型增生-腺癌)进展为食管腺癌.有文献报道约5%的Barrett食管患者发生癌变,较正常人群高出40～100倍[1].环氧合酶(cyclooxygenase,COX)是催化前列腺素样物质合成的关键酶,有COX-1和COX-2两种基因型.COX-1于1976年被提纯,表达于多数正常组织和细胞中,具有多种生理功能,被称为管家基因(house keeping gene).正常食管内皮细胞和肌细胞中只有COX-l表达,几乎无COX-2表达[2].直到1991年,COX-2才在一些实验室被检测到,由于多数正常组织不表达COX-2 mRNA和蛋白,COX-2是一种诱导性即刻反应基因(inducing immediate-early gene),可被多种因素,如生长因子、细胞因子和致癌剂等所诱导.提示COX-2可能在炎症和细胞生长的调控中发挥作用[3～5].
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全基因组关联研究中NanoDrop检测D260/D230值在DNA质检中的意义
目的 探讨NanoDrop检测D260/D230值对全基因组关联研究(GWAS)中DNA标本质检的意义.方法 收集1 494例强直性脊柱炎(AS)患者的血液DNA样本,分别用NanoDrop和PicoGreen检测样本浓度.第一阶段,对24例NanoDrop和PicoGreen浓度＞50 ng/μL的DNA样本行Omni中华8芯片检测,比较16例芯片成功样本与8例失败样本的D260/D280值及D260/D230值.第二阶段,选取1 122例NanoDrop和PicoGreen检测浓度均大于50 ng/μL DNA样本行管家基因GAPDH的PCR检测,并对PCR反应成功的样本行Omni中华8芯片检测.采用Mann-Whitney U检验比较PCR反应成功与失败DNA样本的D260/D230值,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价D260/D230值对PCR结果的鉴别效率.结果 第一阶段中,芯片成功与失败样本的D260/D280值差异无统计学意义(P=0.444),而D260/D230值差异有统计学意义(Z=-3.920,P＜0.001);第二阶段中,PCR成功的DNA样本基因分型检测成功率为100％,PCR成功与失败组的D260/D230值比较差异有统计学意义(Z=-5.983,P＜0.01).D260/D230值预测PCR结果的曲线下面积(AUC)为0.727;佳诊断点的D260/D230值为0.89;特异度为0.95时的D260/D230值为2.305.结论 在进行GWAS时,浓度及D260/I2s0值均较好而D260/D230值较低的DNA样本可能含有较多杂质,需联用PCR检测以确保样本质量;D260/D230值≥2.305时,样本纯度满足GWAS芯片检测的要求,可省略PCR检测.
