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缺血缺氧性脑损伤后神经干细胞和脑组织再生的研究
目的:研究缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injure,HIBI)后神经干细胞(neural stem cells,NSCs) 的增殖、迁移和分化及脑组织的再生能力.方法:大鼠缺血缺氧性脑损伤后腹腔注射5-溴脱氧尿苷(BrdU),损伤后在各观察点,动物麻醉后取脑,石蜡包埋,冠状切片,行HE染色和免疫组织化学染色.结果:缺血缺氧性脑损伤后1周,海马颗粒细胞层下区(Subgranular zone,SGZ)和脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ)可见小蓝紫色核的细胞;损伤后2周,海马可见具有毛刷状轴/树突层的神经元再生,大脑皮层未见神经元再生.缺血缺氧性脑损伤后,SGZ 和SVZ的背外侧角及外侧壁处均可见BrdU+细胞、Nestin+细胞和BrdU+-Nestin+双阳性细胞;并可见这些细胞沿胼胝体向外迁移.结论:缺血缺氧性脑损伤后,海马颗粒细胞层下区和脑室管膜下区的神经干细胞增殖,脑室管膜下区的神经干细胞沿胼胝体向外迁移,海马神经元可完全再生,大脑皮层神经元未见再生.
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同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性
背景:研究表明神经干细胞在脊髓损伤中具有潜在的治疗作用,但何时移植效果较好?目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性.设计:观察对比实验.单位:大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室.方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成.[1] 取孕,14～16d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞.[2]将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只.3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞.观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况.神经干细胞移植4周后,取出移植区脊髓,作切片进行免疫组织化学染色,观察比较各组大鼠的脊髓组织形态学变化.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.主要观察指标:[1]各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况.[2]神经干细胞移植4周后各组大鼠脊髓移植区的组织形态学变化.结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失.[1]各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著.早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,两三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复.[2]移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化;脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色.损伤对照组肉眼见两断端间呈空腔状.镜下脊髓残端变性坏死明显,空泡变性等.延期移植组脊髓移植区的组织形态学变化介于早期移植组和损伤对照组之间,无典型的组织形态学变化特征,镜下有一定量的新生细胞,但数量较早期移植组明显少.结论:同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好.
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国产碱性成纤维细胞生长因子对人神经干细胞体外增殖分化的影响
目的:探讨国产碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对体外培养人神经干细胞增殖、分化的影响,以期寻找一种简便、经济、可靠的人神经干细胞体外培养、增殖的方法.方法:实验于2003-06/2004-03在安阳肿瘤医院临床实验室进行.机械分离8～16周胎龄水囊引产新鲜人胚胎纹状体区脑组织,用DMEM/F12无血清培养基进行培养,加不同剂量的国产bFGF刺激细胞增殖、传统方法进行传代培养,免疫组化染色对培养的细胞进行鉴定.结果:培养体系中加入终浓度28 Au/mL的国产bFGF时,神经干细胞生长旺盛,形成大量悬浮状态的神经球,而且形成的神经球经多次传代仍呈悬浮球生长,绝大多数表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin).结论:用廉价的国产bFGF作为丝裂原体外培养人胚胎纹状体区脑组织,能获得大量神经干细胞,可以为中枢神经系统疾病神经干细胞移植治疗提供经济、可靠的细胞来源.
关键词： 干细胞 神经系统/细胞学 成纤维细胞生长因子2 体外研究 -
人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的研究
目的:探讨人骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源.方法:无菌取成人髂骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(bone marrow stroual cells,BMSCs);在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导为神经元样细胞,通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定;通过高效液相色谱法(HPLC)检测诱导后细胞合成分泌神经递质去甲肾上腺素(NE)的能力.结果:分离得到的成人BMSCs培养10～14 d后,细胞呈半贴壁状,胞体饱满,Nestin抗原染色阳性.培养20 d后,在诱导因子作用下进一步分化为神经元样细胞(NLCs),具有细长双极或多极突起,神经核蛋白(NeuN)抗原表达阳性.HPLC检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到NE,经体外诱导培养8,11d的神经干细胞、体外诱导分化20 d的NLCs均可检测到NE,神经干细胞(8,11d)的NE含量为(10.414 6±1.042 5),(28.335 9±3.837 1)μg/L小于NLCs(20 d)组(52.134 2±3.913 6)μg/L,差异有非常显著性意义(F=126.64,P=0.0000).而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P＜0.05).结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,人BMSCs可被成功诱导为神经细胞,并具有合成分泌神经递质成分的能力.
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兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究
目的:探讨兔骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞,能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分.方法:分离兔BMSCs,应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,免疫细胞化学鉴定;并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量.细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸.结果:BMSCs培养12 d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20 d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质,经体外培养增殖14 d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20 d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为:每1×107细胞中(1.794 0±0.009 5),(4.010±0.117 0)μg/L,差异有非常显著性意义(t=30.632 3,P=0.001).方差分析显示:随着骨髓基质细胞培养天数的增加,其所含的5-羟色胺浓度也渐增加,组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P＜0.01).结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并表达成熟神经元特异性核蛋白,合成、分泌5-羟色胺神经递质.
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体外神经干细胞培养过程中蛋白激酶磷脂酰肌醇-3激酶/AKT信号途径的作用
目的:探讨磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)/AKT信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用.方法:实验于2001-11/2004-04在重庆医科大学神经病学研究所完成.分为对照组、PI3K特异性抑制剂wortmannin组和LY294002组;采用间接免疫荧光法检测nestin,NF-200和GFAP的表达;TUNEL评价细胞凋亡率;Western Blot法检测磷酸化的AKT,caspase-9和bad的表达.结果:随着wortmannin和LY294002浓度增大,神经干细胞的形态变化逐渐明显,而且细胞凋亡率也逐渐增加.低浓度时(wortmannin浓度为5 nmol/L,LY294002浓度为2 μnol/L),神经干细胞凋亡率与对照组无显著性意义(P＞0.05);高浓度时(wortmannin浓度为50,100 nmol/L,LY294002浓度为50,100 μmol/L),神经干细胞凋亡率与对照组、低浓度组有非常显著性意义(P＜0.01).Western Blot结果提示,随着PI3K特异性抑制剂浓度增大,磷酸化AKT的表达逐渐减弱.当高浓度wortmannin(20 nmol/L)和LY294002(10 μmol/L)抑制了AKT磷酸化后,磷酸化的caspase-9,Bad表达减弱.此外,将wortmannin组和LY294002组存活的细胞接种后,分化后细胞的NF-200,GFAP表达无显著性意义.结论:神经干细胞存活依赖于PI3K/AKT途径的活化,其机制可能是PI3K/AKT活化后,促进了Bad和caspase-9等蛋白的磷酸化,抑制了细胞凋亡事件的发生.但是PI3K/AKT途径可能在神经干细胞的分化中的作用甚微.
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兔骨髓源性神经干细胞体外分化为神经元样细胞的功能特性研究
目的:检测由骨髓源性神经干细胞诱导分化而成的神经元样细胞,能否分泌γ-氨基酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神经生物活性物质成分,从而初步推断是否具有神经元的生化特征.方法:无菌条件下抽取新西兰大白兔骨髓,梯度密度离心分离获取骨髓基质细胞(bone marrow stroma cells,BMSCs),在神经干细胞培养基及脑源性神经营养因子(BDNF)等条件下,于体外诱导分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定,并应用高效液相色谱法(HPLC)检测GABA生物活性物质的含量.结果:BMSCs培养12 d可见细胞大而圆,免疫细胞化学检测巢蛋白抗原阳性;培养20d可见具有长突起的神经元样细胞形成,神经元核蛋白免疫细胞化学检查阳性,HPLC检测骨髓源性神经元样细胞含有高浓度GABA神经递质成分.方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,其所含的GABA浓度也渐增加,由每1×107细胞中(3.43±0.25)μmol/L增至(14.69±3.51)μmol/L(F=23.69,P=0.001 4).结论:兔BMSCs在体外条件下可以增殖分化,前期表达Nestin,分化的细胞则可表达NeuN特异性抗体,并含有高浓度的类GABA神经递质成分.
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自体神经干细胞在兔损伤脊髓内存活并分化的实验效果
目的:将新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养、诱导、分化为神经干细胞,并且移植到兔脊髓横断性损伤模型中,观察移植的细胞是否能够存活及分化.方法:兔骨髓基质细胞取自成年兔的股骨或髂骨,体外培养、诱导、分化为神经干细胞,将兔制成脊髓全横断模型.伤后2周将神经干细胞手术方法直视下移植到受损脊髓缺损处,伤后12周将兔行甲醛灌注留取神经干细胞移植处作为标本,行病理及免疫组化染色.并设立脊髓损伤空白对照组(移植后不行神经干细胞移植).结果:移植组与对照组相比,移植组移植部位存在大量5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxy uridine/5-bromo-2-deoxy uridine,BrdU)染色阳性的细胞,表明移植的细胞在体内可以存活;同时,移植组脊髓损伤部位存在神经元特异性烯醇化酶抗体(neuron-specific endase,NSE)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(glial fibrillary acidic protein,GFAP)染色阳性的细胞,表明移植的细胞可以分化为具有神经元或胶质细胞特征的细胞.结论:自体神经干细胞在损伤脊髓内可以存活并能分化为类神经组织细胞
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碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子对恒河猴骨髓源性神经干细胞的体外诱导增殖作用
目的:探索骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外诱导分化为神经干细胞(nerve stem cells,NSCs)的增殖条件,比较碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)对神经干细胞生长曲线的影响,为BMSCs在神经科学领域内的应用提供参考.方法:以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象,实验组利用NSC培养基和bFGF,EGF生长因子,进行体外培养、诱导、增殖.对照组用神经干细胞培养基进行培养增殖.Nestin及CD133作为免疫细胞化学鉴定NSCs的细胞标志.结果:原代培养第6天时多数细胞表现为Nestin及CD133抗原阳性,此后实验组及对照组细胞数量开始明显扩增,但实验组增殖更为明显,bFGF+EGF组从第8天时的(96.30±8.78)×104增加到第18天时的(1 407.90±26.62)×104,并且增殖开始的时间较对照组提前2 d.NSCs在10 d后有少量细胞向神经元和神经胶质细胞分化.结论:bFGF与EGF联合应用能够促使NSCs增殖时间提前及增殖效能显著提高.另外,bFGF和EGF还具有诱导NSC向神经细胞分化的作用.
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移植神经干细胞对血管性痴呆大鼠的行为学效应
目的:移植神经干细胞于血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠海马,研究移植后大鼠的行为学疗效.方法:实验于2002-09/2003-12在解放军南京军区福州总医院实验动物中心进行.①利用无血清培养和单细胞克隆技术从新生大鼠脊髓分离具有单细胞克隆能力的细胞群并连续传代培养,获得大量克隆细胞.②永久性结扎大鼠双侧颈总动脉法建立VD模型,结扎后饲养30 d,以Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验来检测大鼠的空间记忆能力.③利用脑立体定位技术将5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)标记后的神经干细胞移植入VD大鼠海马内,饲养8周后以Morris水迷宫来检测大鼠的空间记忆能力.结果:神经干细胞移植后8周,假手术组平均逃避潜伏期为(25.61±3.21)s,痴呆组的平均逃避潜伏期为(53.42±8.26)s,两组比较差异有显著性意义(F=7.82,P＜0.01),移植组平均逃避潜伏期(36.93±6.24)s,两组比较差异有显著性意义(F=8.23,P＜0.01),移植组平均逃避潜伏期与假手术组相比差异无显著性意义(F=5.77,P＞0.05).痴呆组、移植组及假手术组大鼠在平台象限的平均滞留时间分别为(8.21±2.90),(11.82±3.08),(13.48±3.35)s,痴呆组、移植组比较差异有显著性意义(F=9.76,P＜0.01),痴呆组、假手术组比较差异有显著性意义(F=10.21,P＜0.01),假手术组、移植组比较无显著差异(F=5.79,P＞0.05).结论:神经干细胞移植至海马,能够改善VD大鼠空间学习记忆能力.
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胚脑来源与骨髓来源神经干细胞的比较:应用原子力显微镜的观察
目的:应用原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)观测胚鼠前脑来源的神经干细胞及成鼠骨髓诱导来源的神经干细胞表面的形貌结构,并比较两者的异同.方法:实验于2003-09/2004-09在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成.分别取怀孕10.5～14.5 d胚鼠行前脑来源神经干细胞和成鼠骨髓来源神经干细胞培养,神经干细胞培养基、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20 μg/L)维甲酸(300 μg/L)持续诱导培养10 d,以平板克隆法测定两种来源干细胞的克隆形成率,光学显微镜和原子力显微镜分别进行观测.结果:光学显微镜下两种来源的神经干细胞均表现为大圆形细胞,直径6～12 μm,细胞形貌相似;但神经来源神经干细胞显示更强的增殖能力,其细胞克隆形成率显著大于骨髓来源神经干细胞(x2=4.444,P＜0.05);原子力显微镜下可观测到神经来源干细胞表面有较多颗粒样隆起,其表面粗糙,平均粗糙度为(18.5±2.0)nm,均方根粗糙度为(20.7±2.5)nm,而骨髓来源神经干细胞表面相对光滑,其表面平均粗糙度为(10.2±1.2)nm,均方根粗糙度为(12.9±1.3)nm,两者经t检验统计分析差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:神经来源神经干细胞较骨髓来源神经干细胞表面有更多颗粒样隆起,表面更粗糙,可能与其有更强的增殖能力有关.
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脑源性神经营养因子对骨髓基质细胞分化过程中致瘤性的影响
目的:观察脑源性神经营养因子对体外培养骨髓基质细胞致瘤性的影响.方法:实验于2003-05/2004-06在南方医科大学临床解剖学研究所及珠江医院神经医学研究所完成.分离培养大鼠骨髓基质细胞,用含有脑源性神经营养因子受体trkB基因的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP)-C2-trkB转染骨髓基质细胞.分别收集转染了增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB及增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2的细胞,以未转染的骨髓基质细胞为阴性对照,采用半定量的反转录聚合酶链式反应法测定各组细胞中trkB信使核糖核酸(trkB mRNA)的表达水平.在培养基中加入脑源性神经营养因子,应用双层软琼脂糖培养的方法,观察经过不同处理的细胞的克隆形成率.结果:增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB可高效地转染骨髓基质细胞.转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB组trkB信使核糖核酸表达水平明显高于未转染细胞组及转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2细胞组[13.607 3±1.895 7,0.305 2±0.004 3,0.307 5±0.003 7,(P＜0.05)].转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2-trkB组克隆形成率明显小于转染增强型绿色荧光蛋白真核表达载体-C2细胞组、未转染细胞组及胶质瘤细胞U251组[0.234 7±0.038 9,0.675 1±0.050 6,0.702 3±0.046 7及7.338 1±0.681 3,(P＜0.05)]. 结论:脑源性神经营养因子可降低骨髓基质细胞分化过程中的致瘤性,抑制骨髓基质细胞向肿瘤细胞方向分化.
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丹参素和丹酚酸对胎鼠脑神经干细胞迁移的诱导
目的:以丹参水溶性成分丹参素、丹酚酸为干预药物,观察其对胎鼠脑神经干细胞迁移的诱导作用.方法:实验于2006-03/08在广州暨南大学医学院完成.①丹参素(粉剂,纯度大于90%,昆明长春花科技公司生产,批号1108552200203);丹酚酸(粉剂,纯度大于90%,昆明长春花科技公司生产,批号CCH601012);MBG96型趋化小室(Neuro Probe公司).②取妊娠13.5 d昆明种小鼠2只,处死后取出粉鼠,分离其胎脑神经下细胞进行传代培养.取培养至对数生长期的细胞,采用Boyden小室法观察细胞迁移情况.取单细胞悬液50 μL,分别加人Boyden小室的12个上室;取分别含有5,10,20,40,80,100 mg/L丹参素和5,10,20,40,80,100 mg/L丹酚酸的DMEM培养基各450 μL,加入Boyden小室的12个下室;另2孔以不含丹参素和丹酚酸的DMEM培养基作为空白对照.上下两室以预先包被Ⅰ型胶原的聚碳酸酯微孔滤膜相隔.将Boyden小室置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24 h,取出徽孔滤膜,用甲醇将迁移至微孔滤膜下层的细胞固定,Nissl染色,显微镜下随机选择3个不同视野,计数膜上不同层次的细胞数.③选取昆明种小鼠18只,随机数字表法分为生理盐水对照组、丹参素组、丹酚酸组,6只/组.丹参素组于侧脑室内连续注射80 mg/L丹参素5 μL,丹酚酸组注射40 mg/L丹酚酸5 μL,生理盐水对照组注射等量生理盐水,共3 d,术后14 d处死,取脑,制备切片,行ABC免疫细胞化学染色,观察丹参素和丹酚酸干预后nestin阳性神经元的分布变化.结果:18只小鼠全部进入结果分析.①不同质量浓度的丹参素对神经干细胞迁移诱导:与空白对照比较,5,10 mg/L的丹参素促神经干细胞迁移的作用并不明显(t=1.037,1.374,P＞0.05);20,40 mg/L的丹参素可明显促进神经干细胞的迁移(t=2.894,3.468,P＜0.01);当丹参素质量浓度为80 mg/L时促迁移作用为强烈(t=4.031,P＜0.01),之后有所减弱.②不同浓度的丹酚酸对神经干细胞迁移的诱导:与空白对照比较,5 mg/L的丹酚酸促神经干细胞迁移的作用并不明显(t=1.365,P＞0.05);10,20 mg/L的丹酚酸可明显促进神经干细胞的迁移(t=3.021,3.947,P＜0.01);当丹酚酸质量浓度为4O mg/L时促迁移作用为强烈(t=4.342,P＜0.01),之后有所减弱.③丹参素和丹酚酸对小鼠室管膜下nestin阳性神经元迁移的影响:丹参素组侧脑室内侧和外侧的nestin阳性细胞的数量多于生理盐水对照组,而且并不局限于侧脑室周围区,在脑皮质和尾壳核可见少量的阳性细胞,细胞的突起明显,伸向皮质方向,侧脑室内侧的阳性细胞有相似的特征.丹酚酸组侧脑室周围的阳性细胞数量多,而且在皮质和尾壳核检测到大量的阳性细胞.结论:丹参素和丹酚酸均具有诱导胎鼠脑神经干细胞迁移的作用,且丹酚酸的作用优于丹参素.
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同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性观察
目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性.方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成.①取孕14～16 d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞.②将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只.3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3 d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞.观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况,通过胶质原纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色法观察各组大鼠的脊髓组织形态学变化,胶质原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞特异性标志蛋白,神经元特异性烯醇化酶是神经元特异性蛋白.结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失.①各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著.早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,二三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复.②移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化:脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色(胶质原纤维酸性蛋白(+),神经元特异性烯醇化酶(+)).结论:神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好.
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脊髓损伤后神经营养因子及干细胞治疗对轴突再生的影响:国外基础和临床研究新进展
背景:近几年国外学者在脊髓损伤的病理机制、损伤后神经元的保护、少突胶质细胞的再生及神经干细胞的移植治疗等研究方面取得了实质性地进展.介绍国外近10年来对脊髓损伤的新认识,新研究成果及未来的科研和治疗方向.资料来源:应用计算机检索Medline数据库1987-01/2006-10脊髓损伤的相关文章,限定文章语言种类为English,检索词为"脊髓损伤;神经干细胞;轴突;神经营养因子;动物模型",进行不同组合,选出相关文章.资料选择:对资料进行初审,选择脊髓研究中的与神经干细胞及神经营养因子有关的研究文献查找全文.纳入标准:①脊髓损伤中以探讨其机制及新治疗方法的文章.②探讨脊髓损伤后轴突再生,生长锥作用,引导再生方向的靶点,突触再形成及功能重建的文章.③神经营养因子和内源性神经干细胞治疗的文章.排除标准:①未被SCI收录的文章,相类似的研究.②无英文摘要的文章.资料提炼:共收集到相关文献1 166篇,按上述标准纳入101篇,实际采用61篇,脊髓损伤机制相关文献12篇,轴突再生相关文献14篇,增长锥作用相关文献8篇,少突胶质细胞相关文献8篇,神经干细胞相关文献7篇,神经生长因子相关文献12篇.其余文献均被排除.资料综合:①脊髓损伤功能恢复的基础:损伤的轴突再生及增长;轴突穿透损伤瘢痕区的能力;轴突朝着正确的靶区方向再生;轴突增长到一定程度后停止,终端形成突触,与神经元相接;神经传递功能重建及运动功能重新恢复.②脊髓损伤的神经病理分析:脊髓损伤后的原发性损害、继发性损害.③脊髓损伤的分子生物学机制包括3个方面:对于成年人中枢神经系统损伤后的神经元的发展、再生,神经元通路的建立起着重要的作用轴突增长锥;对轴突的再生起到抑制作用中枢神经系统髓鞘蛋白;细胞膜和细胞内信号传递.④脊髓损伤中起重要作用的细胞和因子:少突胶质细胞,白血病抑制因子和Minocycline,内源性神经干细胞.⑤脊髓损伤动物模型:常使用的模型是全部离断、部分离断模型和挫伤模型.⑥脊髓损伤研究的前景:已经开始把动物实验中神经营养因子和神经干细胞治疗发现用于临床,如白血病抑制因子在国外已经开始临床Ⅳ期实验,对内源性神经干细胞的诱导调控增殖研究也已经越来越受到重视.结论:神经营养因子干预治疗及神经干细胞治疗使脊髓损伤后的功能恢复成为可能.进一步探讨神经营养因子引起轴突再生的机制,将是脊髓损伤研究领域的未来方向,了解引导调控神经干细胞的增殖和分化方向,将在修复脊髓损伤方面发挥巨大的作用.
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绿荧光蛋白标记人骨髓源性神经干细胞的体外实验研究
目的:探讨重组腺相关病毒包装绿荧光蛋白(rAAV-GFP)标记人骨髓源性神经干细胞(BM.NSCs)的可行性,为进一步行标记细胞移植实验研究奠定基础. 方法:以成人自愿者的骨髓为研究对象,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞并用" Cytokine@神经干细胞培养基"诱导分化为神经干细胞,分化的细胞以免疫细胞化学鉴定.对接种生长的 BM.NSCs(1×105～6/mL)以无血清培养基冲洗并重悬细胞,依佳病毒感染指数(MOI)为 105的标准计算、加入包装了 GFP的 rAAV病毒颗粒,连续培养 12 h(37℃,50 mL/L CO2)以感染细胞;补加100 g/L胎牛血清后,于神经干细胞培养基中继续细胞培养24 h(37℃,50 mL/L CO2)以上,荧光显微镜(Olympus IX70, Japan)追踪观察 rAAV GFP标记的 BM.NSCs. 结果:BM.NSCs于标记后 1周内见不到GFP阳性表达 ; 在标记10 d后才出现有GFP阳性表达情况 (平均每个200倍镜下视野可见到 5～10个GFP阳性细胞),所标记的细胞在荧光显微镜下呈亮绿色;随着培养时间延长,BM.NSCs表达GFP也逐渐增强、阳性细胞数量逐渐增多,并可于 1个月时明显(标有 GFP阳性的细胞可达 BM.NSCs总数的60%),追踪观察到到2.5个月时亦未见衰减. 结论:rAAV GFP在人骨髓源性神经干细胞中的表达较迟,但呈渐强趋势; rAAV GFP标记人骨髓源性神经干细胞具有可行性.
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人、鼠神经干细胞的生物特性比较
目的:比较分析体外人及小鼠神经干细胞原代培养的生长特性. 方法 :用无血清培养与单细胞克隆技术对人及鼠胚胎脑组织进行分离、培养.借用光镜、免疫组织化学对其鉴定,应用透射电镜对不同生长时期神经干细胞生物学特性进行观察. 结果 :人和鼠胚胎分离的细胞具有连续分化及克隆能力,克隆球与早期的原始细胞神经上皮干细胞蛋白(nestin)抗原呈阳性.诱导后成熟分化的细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经丝200(NF-200)抗原呈阳性.小鼠神经干细胞电镜结果:1周时,细胞发育较为原始,核大胞质少,细胞器不发达,未观察到细胞突起及神经元与星形胶质细胞具备的特征.培养2周后,其电镜结果与 1周结果无明显区别.继续培养到4周,见大部分细胞内出现空泡样变性,部分细胞表现出神经元及星形胶质细胞的一些特征.另外在克隆求内观察到类似细胞连接样结构.而人神经干细胞特性与小鼠神经干细胞相似,空泡样变性比小鼠神经干细胞更为明显.人与鼠神经干细胞经诱导分化10 d后,见到典型的神经元及星形胶质细胞特征. 结论 :人及鼠神经干细胞具有很强的增殖能力,生物特性相似.
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脑溢安颗粒对实验性大鼠脑出血后神经干细胞增殖的影响
目的:探讨中药脑溢安颗粒对脑出血后神经干细胞反应的影响. 方法:72只雄性SD大鼠单纯随机分为假手术组、模型组、脑溢安组,采用 Rosenberg方法复制大鼠脑出血模型,分别给予不同处理,于术后 1,12 h,1,3,5,7 d处死动物,运用免疫组织化学,Western blot方法检测脑出血后各组的nestin表达. 结果:脑出血后, nestin阳性细胞增多,1 d达高峰,然后逐渐降低,维持到第7天,nestin阳性细胞主要分布在海马、皮质区,且脑溢安组与模型组 1 d前各时间点差异无显著性意义( P >0.05),3 d后各时间点差异有显著性意义(t分别为 3.081,8.034,5.833,P< 0.05～0.01); nestin蛋白表达有相同趋势. 结论 :正常脑组织中存在一定数量的神经干细胞,脑出血后神经干细胞被激活增殖,中药脑溢安能维持促进增殖,这种作用可能是通过调节细胞外因子来实现.
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人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点
目的:探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法.方法:实验于2003-09/2004-12在重庆医科大学基础研究所完成.人胚胎来源为7～12周人工药物流产胎儿,由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供,征得产妇本人同意.①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞,经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞.②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原.③观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响,分析其生长特点并绘制生长曲线.④采用悬浮细胞培养法扩增细胞,冷冻复苏后观察细胞的生物学特性.结果:①人胚胎神经干细胞体外生长特点:从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞.经体外传至15代,神经干细胞细胞数量扩增至200倍.②神经干细胞接种密度对增生的影响:当种植细胞的密度为1×105 L-1,1×107 L-1时,体外培养30 d后仍呈单细胞贴壁状态.以1×109 L-1细胞密度接种时,12 h后即见多个单细胞聚成的小球,悬浮生长.③神经干细胞自我更新能力的检测结果:多数单个细胞在培养后24～48 h分裂为2～4个细胞的小克隆,7～10 d均发展为上百个细胞的较大的克隆.④nestin抗原的表达:培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性.⑤神经干细胞多向分化能力检测:NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示,被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着,呈阳性表达.⑥神经干细胞复苏后的存活率:冻存1,4,8,12周的神经干细胞存活率基本相似[(80.2±1.8)%,(80.1±1.2)%,(79.9±0.8)%,(80.1±2.1)%,P＞0.05].结论:成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞.经体外培养证明:人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能.
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胎鼠纹状体神经干细胞分离培养方法的改进
目的:利用有血清和多聚赖氨酸培养液中加入SD 14d胚胎大鼠纹状体区神经干细胞,探讨其分离、纯化神经干细胞操作技术的改进.方法:实验于2003-03/2004-11在广州第一军医大学珠江医院神经外科实验室完成.①选用SD大鼠20只,取孕13～14 d的SD大鼠胚胎纹状体,吸管吹打(不超过10次)后,用组织剪剪成1 mm3块状,以1.25 mL/L的胰酶,在37℃下消化20 min,以S-Dulbecco改良的Eagle培养基-F12中止消化,采用1 000 r/min离心10 min,显微镜下细胞记数,以1×104/cm2接种到改良的有血清和多聚赖氨酸铺被的12孔培养板上,培养液为Dulbecco改良的Eagle培养基-F12加上B27,加入血清和20μg/L表皮生长因子.7d后用吸管吸取漂浮的细胞球,机械吹打成单细胞悬液,按每培养孔1×104/cm2细胞行传代再培养,此后5～7d再传代,方法同前.②利用神经干细胞与星形胶质细胞、神经细胞以及成纤维细胞贴壁之间的差异,使细胞分为贴壁和漂浮的两层细胞,分离去掉贴壁的神经细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞以及部分的神经干细胞,得到漂浮的细胞球.③机械吹打后制成单细胞悬液,再传代培养,细胞重新增殖成细胞球,应用免疫细胞化学技术特异性抗原巢蛋白检测初的细胞球、吹打后的单细胞和重新增殖的细胞球巢蛋白抗原的表达和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达.巢蛋白为神经干细胞特异性标记物,其阳性表达表明神经干细胞的存在.结果:①原代培养的纹状体细胞第2天可见贴壁生长的神经细胞、星形胶质细胞和增殖的细胞球(约10～16个细胞大小),漂浮的细胞开始出芽并增殖;第3天贴壁的细胞球继续增殖(约50个细胞大小),漂浮的细胞则增殖成4～8个大小的细胞球;第4～7天贴壁的细胞球开始分化,漂浮的细胞则继续增殖成约30个细胞大小的细胞球,巢蛋白染色阳性.②漂浮的细胞,吹打后行传代培养,加入表皮生长因子、血清和多聚赖氨酸,细胞仍漂浮生长,1周后增殖成约70～80个细胞大小的细胞球,吸管吹打继续再培养,细胞仍漂浮增殖成细胞球,巢蛋白抗原表现阳性.③免疫细胞化学染色显示原代培养中贴壁的细胞球、吹打后的单细胞、漂浮的细胞球巢蛋白染色阳性,吹打后的细胞若不加入表皮生长因子,则细胞染色显示胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白阳性.分离纯化后的细胞具有自我更新能力和多分化潜能,有很强的增殖能力.结论:利用有血清和多聚赖氨酸加入的方法分离培养的原代细胞球巢蛋白表达阳性,具有纯化度高,存活时间长的特点.
