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人聚角微丝蛋白基因克隆表达及其抗体在类风湿关节炎诊断中的价值
目的 通过克隆人聚角微丝蛋白(filaggrin)基因,构建重组表达质粒,获得具活性的纯化重组蛋白,建立人AFA间接ELISA检测法,以评价AFA在RA诊断中的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,建立间接ELISA检测AFA方法,并用于检测114例RA患者、56例SLE患者、32例OA患者及40名健康体检者血清中抗人AFA;分析AFA和抗CCP抗体诊断RA的相关性.结果 扩增出321 bp人filagrin基因片段,构建了具有正确序列的质粒载体pET-28a(+)-filaggrin,转化大肠杆菌Rosettagami(DE3)中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS-PAGE分析,在相对分子质量为14 000处出现新生蛋白带.用Ni-NAT树脂纯化后得到具有活性的纯化人filaggrin重组蛋白.间接ELISA检测标本血清结果显示,RA组AFA检测吸光度(A)值为0.473±0.248,与SLE组、0A组及健康对照组的A值(分别为0.160±0.088、0.050±O.018、0.121±0.040)两两组间比较,差异具有统计学意义(t值分别为12.004、14.464、18.078,P均<0.01).AFA在RA组、SLE组及OA组阳性率分别为48.2%、5.4%和3.1%.RA组AFA阳性率与SLE组、OA组及健康对照组比较,差异有统计学意义(x~2=67.088,P<0.01).AFA与抗CCP抗体对RA的诊断呈正相关(r=0.42,P<0.05).AFA与抗CCP阳性一致率为70.1%,114例患者中有10例患者抗体CCP阴性,而AFA检测结果为阳性.AFA对RA诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为48.2%、96.9%、93.2%和67.9%.结论 用纯化fitaggrin融合蛋白建立的间接ELISA检测抗人AFA的方法,对RA诊断具有较好敏感度和特异度,AFA与抗CCP抗体共同检测可提高检测阳性率.
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神经中间丝蛋白NF-66与胰岛素瘤良恶性的关系
目的 探讨神经中间丝蛋白NF-66能否作为判断胰岛素瘤良恶性的分子标志物.方法 采用免疫组织化学染色法检测胰岛素瘤组织、瘤旁胰腺组织及3株胰岛素瘤细胞株NF-66蛋白的表达,应用单因素及多因素统计分析胰岛素瘤NF-66蛋白表达与肿瘤病理特征及患者预后的相关性.结果 132例胰岛素瘤组织中102例(77％)表达NF-66蛋白,98例瘤旁胰腺组织均未见该蛋白表达(P=4.86×10-31)；3株胰岛素瘤细胞株均高表达NF-66蛋白.118例良性胰岛素瘤中96例(81％)表达NF-66,而14例恶性胰岛素瘤中6例(43％)表达NF-66,恶性胰岛素瘤的表达显著下降(P =0.003).胰岛素瘤NF-66表达与肿瘤大小(以3cm为界)、远处转移、远处并淋巴结转移均呈显著负相关(46％比81％,P=0.009；38％比81％,P=0.013;43％比81％,P=0.010)；而与患者性别、年龄、肿瘤复发和生存状态不相关.结论 胰岛素瘤中NF-66表达下调与肿瘤的恶性生物学特征有关,可能成为潜在的鉴别胰岛紊瘤良恶性的分子标志物.
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大鼠脑缺血后脑组织巢蛋白的表达
目的探讨脑缺血对巢蛋白表达的影响.方法按照改良Haruo Nagasawa方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(CMAO)缺血模型,分别在脑动脉栓塞后12、24、48、96h、7 d及14 d灌注取脑,行冷冻切片.以小鼠抗大鼠巢蛋白单克隆抗体为一抗,免疫组织化学SABC法染色,DAB显色,光镜下观察.结果手术组CMAO后12 h在脑缺血的边缘区开始出现巢蛋白阳性细胞,7 d后巢蛋白表达达到高峰,14 d时在围绕脑梗死边缘的狭窄区域内仍有明显表达,但较7 d时有所降低.阳性部位在胞质和细胞突起.假手术组和手术组对侧脑组织未见巢蛋白的明确表达.结论脑缺血损伤使脑梗死边缘缺血区的反应性星形胶质细胞和新生微血管出现巢蛋白的重新表达,这种重新表达可能在组织修复中起一定作用.
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四种中间丝蛋白在大鼠视网膜发育过程中表达的时间顺序和结构特征
目的研究视网膜内神经干细胞的标志物及其表达的时间和空间分布特征.方法利用免疫组化染色,检测四种中间丝蛋白(Nestin、Vimentin、GFAP及NF)在新生至12月龄大鼠视网膜内表达的时间顺序、空间分布和强度变化.结果大鼠视网膜结构的分化要到出生后2周才能完成.在2周内Nestin的表达可见于视网膜的神经细胞、胶质细胞、血管内皮细胞内.2周后表达水平明显降低.4周时完全转阴.但在睫状体的少数突起内,Nestin持续高水平表达,成年时,阳性细胞以色素上皮细胞为主.此外,在成年大鼠的视神经内也可见散在的Nestin阳性细胞.Vimentin在神经胶质细胞和睫状体的无色素上皮细胞中一直呈强阳性.除了文献报道的水平细胞外,我们还发现Vimentin 在4周内的Müller细胞和无长突细胞内表达.GFAP和NF仅在发育成熟的神经胶质细胞和神经节细胞的轴突内表达.结论 Nestin可作为视网膜神经干细胞的标志,成年时视网膜的神经干细胞分布在少数睫状突及视神经内.
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成人睫状体-视网膜区域神经巢蛋白阳性细胞的分布特征
目的 探讨成人眼睫状体-视网膜区域神经巢蛋白nestin阳性细胞的分布特征.方法 由广东省眼库提供8只新鲜瘁死的健康成人眼球和3只婴儿眼球,分别采用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白nestin在睫状体、视网膜中的表达,通过透射电镜观察其超微结构和分布特点.结果 睫状体、视网膜中均有少量nestin阳性细胞表达,其散在分布于睫状体色素上皮层和视网膜内核层靠近外核层的一侧;RT-PCR检测到睫状体、视网膜中均有nestin基因mRNA的表达,睫状体中的表达量高于视网膜区域;透射电镜观察可见睫状体和视网膜组织中均存在一些核大而圆、核仁明显、细胞器较幼稚的具有神经干细胞特征的细胞,位于睫状体色素上皮靠近基底膜的区域及视网膜内核层与外核层之间.结论 成人睫状体-视网膜中存在一些具有神经干细胞特征的神经巢蛋白nestin阳性细胞,主要分布于睫状体色素上皮层和视网膜内核层.
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人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞联合培养的实验研究
目的:探讨体外分层共培养条件下大鼠激活态雪旺细胞对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生长及分化的影响.方法:分离、培养人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞,通过Millicell小室实现两者体外共培养,根据共培养与否分为共培养组与对照组,通过巢蛋白(Nestin)、神经丝蛋白200(NF200)免疫荧光染色分析干细胞分化情况.结果:共培养组两种细胞在Millicell小室分层共培养条件下,hUCMSCs逐渐出现类似神经细胞的形态,对照组形态无明显变化.共培养组中hUCMSCs表达神经干细胞标志物Nestin,共培养1d后逐渐降低,而对照组仅低表达Nestin,共培养8h～7d,两组间差异有统计学意义(P＜0.01)；共培养组细胞共培养1d后hUCMSCs表达神经元标志物NF200,而对照组始终不表达NF200.结论:人脐带间充质干细胞有向神经细胞分化的能力,分层培养条件下大鼠激活态雪旺细胞可促进其神经方向分化.
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丹参素和丹酚酸对胎鼠脑神经干细胞迁移的诱导
目的:以丹参水溶性成分丹参素、丹酚酸为干预药物,观察其对胎鼠脑神经干细胞迁移的诱导作用.方法:实验于2006-03/08在广州暨南大学医学院完成.①丹参素(粉剂,纯度大于90%,昆明长春花科技公司生产,批号1108552200203);丹酚酸(粉剂,纯度大于90%,昆明长春花科技公司生产,批号CCH601012);MBG96型趋化小室(Neuro Probe公司).②取妊娠13.5 d昆明种小鼠2只,处死后取出粉鼠,分离其胎脑神经下细胞进行传代培养.取培养至对数生长期的细胞,采用Boyden小室法观察细胞迁移情况.取单细胞悬液50 μL,分别加人Boyden小室的12个上室;取分别含有5,10,20,40,80,100 mg/L丹参素和5,10,20,40,80,100 mg/L丹酚酸的DMEM培养基各450 μL,加入Boyden小室的12个下室;另2孔以不含丹参素和丹酚酸的DMEM培养基作为空白对照.上下两室以预先包被Ⅰ型胶原的聚碳酸酯微孔滤膜相隔.将Boyden小室置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24 h,取出徽孔滤膜,用甲醇将迁移至微孔滤膜下层的细胞固定,Nissl染色,显微镜下随机选择3个不同视野,计数膜上不同层次的细胞数.③选取昆明种小鼠18只,随机数字表法分为生理盐水对照组、丹参素组、丹酚酸组,6只/组.丹参素组于侧脑室内连续注射80 mg/L丹参素5 μL,丹酚酸组注射40 mg/L丹酚酸5 μL,生理盐水对照组注射等量生理盐水,共3 d,术后14 d处死,取脑,制备切片,行ABC免疫细胞化学染色,观察丹参素和丹酚酸干预后nestin阳性神经元的分布变化.结果:18只小鼠全部进入结果分析.①不同质量浓度的丹参素对神经干细胞迁移诱导:与空白对照比较,5,10 mg/L的丹参素促神经干细胞迁移的作用并不明显(t=1.037,1.374,P＞0.05);20,40 mg/L的丹参素可明显促进神经干细胞的迁移(t=2.894,3.468,P＜0.01);当丹参素质量浓度为80 mg/L时促迁移作用为强烈(t=4.031,P＜0.01),之后有所减弱.②不同浓度的丹酚酸对神经干细胞迁移的诱导:与空白对照比较,5 mg/L的丹酚酸促神经干细胞迁移的作用并不明显(t=1.365,P＞0.05);10,20 mg/L的丹酚酸可明显促进神经干细胞的迁移(t=3.021,3.947,P＜0.01);当丹酚酸质量浓度为4O mg/L时促迁移作用为强烈(t=4.342,P＜0.01),之后有所减弱.③丹参素和丹酚酸对小鼠室管膜下nestin阳性神经元迁移的影响:丹参素组侧脑室内侧和外侧的nestin阳性细胞的数量多于生理盐水对照组,而且并不局限于侧脑室周围区,在脑皮质和尾壳核可见少量的阳性细胞,细胞的突起明显,伸向皮质方向,侧脑室内侧的阳性细胞有相似的特征.丹酚酸组侧脑室周围的阳性细胞数量多,而且在皮质和尾壳核检测到大量的阳性细胞.结论:丹参素和丹酚酸均具有诱导胎鼠脑神经干细胞迁移的作用,且丹酚酸的作用优于丹参素.
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昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特异性标志物巢蛋白的鉴定
探讨胰腺干细胞的分离、培养及其特异性标志物巢蛋白鉴定的基本技术方法.选取新生昆明种小鼠25只,分离胰腺组织,Ⅴ型胶原酶消化,结合自然沉降技术形成不连续密度梯度离心.分别从磷酸盐缓冲液/1.068 g/L Percoll液(第一界面)、1.068 g/L Percoll液/1.096 g/LPercoll液(第二界面)、1.096 g/L Percoll液/1.188 g/L Percoll液(第三界面)收集细胞.各界面细胞均加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM低糖培养基,置于经多聚赖氨酸处理的培养瓶中常规培养.24 h后将培养基更换为不含胎牛血清的DMEM低糖培养基,并加入10 mg/L的角质细胞生长因子和20 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子,观察体外培养的各界面细胞的形态学特征.胰腺的内分泌部存在β细胞,双硫腙能与β细胞分泌颗粒中的锌螯合而呈现铁红色.将收集的各界面细胞进行双硫腙染色,检测细胞来源.免疫组织化学法检测各界面巢蛋白的表达.结果第一、二界面细胞65%～90%双硫腙染色呈阳性,来源于胰腺的内分泌部;第三界面细胞双硫腙染色呈阴性,来源于胰腺的外分泌部.从胰腺的内分泌部获得的细胞聚集呈胰岛样细胞团贴壁生长,48～72 h后可见许多大、圆、单个核的细胞从胰岛样细胞团中向周围长出,以附壁生长的方式在局部形成细胞集落.从胰腺的外分泌部获得的细胞主要呈上皮样生长,并逐渐汇合成片,在上皮样细胞集落的周围可见大、圆、单个核的细胞生长并形成集落.各界面大、圆、单个核的细胞,巢蛋白均呈阳性表达.提示从胰腺内、外分泌部的组织中能成功获取胰腺干细胞特异性标志Nestin表达阳性的干样细胞.
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黄体酮对大鼠脑创伤后神经干细胞增殖的影响
背景:脑创伤一定程度上可刺激神经干细胞增殖,而黄体酮可改善脑创伤后学习记忆功能,黄体酮可能通过刺激神经干细胞增殖,促进脑创伤后神经功能的恢复.目的:观察黄体酮对弥漫性脑创伤后神经干细胞增殖的影响.设计:随机对照动物实验.单位:新乡医学院.材料:成年健康雄性SD大鼠48只,四五个月龄,体质量280～330 g.方法:实验于2004-09/2005-02在新乡医学院完成.采用Marmarou弥漫性脑创伤模型.48只大鼠随机分为4组,每组12只:①假手术组,仅切开头皮后缝合.②脑创伤组,建立脑创伤动物模型.③二甲基亚砜组,脑创伤后1 h及以后每天腹腔注射与黄体酮组等容量的二甲基亚砜.＃④黄体酮组,脑创伤后1 h及以后每天腹腔注射黄体酮4 mg/kg.于假手术或脑创伤手术后3,6 d处死动物,苏木精-伊红染色观察大脑皮质神经元形态学变化,免疫组织化学染色检测海马和齿状回巢蛋白表达情况.主要观察指标:神经元组织形态学观察;海马和齿状回巢蛋白表达检测.结果:①假手术组大鼠皮质无神经元损伤,脑创伤3 d组和6 d组大鼠皮质显示明显的神经元损伤,有神经元缺失,黄体酮3 d组和6 d组所显示的神经元损伤均明显轻于脑创伤组.②假手术组齿状回巢蛋白呈低水平或少量表达,海马CA4区偶见巢蛋白表达.脑创伤组海马CA4区和齿状回巢蛋白表达则明显增多(P＜0.05),黄体酮组大鼠海马CA4区和齿状回巢蛋白的表达与脑创伤组比较明显增多(P＜0.05).③脑创伤组和二甲基亚砜组在神经元损伤和巢蛋白表达方面无明显差别(P＞0.05).结论:黄体酮减轻脑创伤作用可能与其促进神经干细胞增殖有关.
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新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性
目的:观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性.方法:实验于2005-11/2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成.①在无菌条件下,利用显微解剖分离新生小鼠(出生后2 d内)脊髓,采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液,离心,弃去上清液,加入干细胞培养液(含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,20 μg/L表皮生长因子,B27辅助培养液),以1×108 L-1密度接种于25 mL培养瓶中,进行原代培养.②将原代培养7 d左右的细胞再次离心,弃去上清,加入干细胞培养液,机械吹打成单细胞悬液,以5×107 L-1密度进行传代培养,每六七天传代1次.③机械吹打制成的单细胞悬液,经过传代培养,重新增殖为神经球,采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞,用体积分数为0.1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后,用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白,胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况.结果:①脊髓源性神经干细胞形态学观察:在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块,称之为"神经细胞球";随着培养时间的延长和多次传代换液,细胞增殖迅速,神经细胞球数目明显增多.②脊髓神经干细胞的分化与鉴定:将神经球转入含体积分数为0.1的胎牛血清的培养液中,数小时内迅速贴壁并开始分化,5 d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态;免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性.结论:新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们可以在体外大量增殖,经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化.
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吗啡对小鼠室管膜上皮、中央灰质及海马结构中巢蛋白表达的影响
目的:观察吗啡对小鼠脑组织巢蛋白(nestin)表达的影响. 方法:20只小鼠随机分为对照组和实验组(n=10).对照组每只小鼠每日皮下注射生理盐水0.1 ml,实验组每只小鼠每日注射吗啡0.1 ml(1 mg).30 d后处死小鼠,开颅取脑并制成石蜡切片,免疫组织化学法观察不同部位脑组织nestin的表达,用图像分析系统进行分析.结果:对照组的室管膜上皮、中央灰质、室周灰质和海马结构中巢蛋白呈弱阳性表达,平均灰度值为150.98±13.31;其中有5类巢蛋白阳性细胞:第一类为室管膜上皮的基底细胞,第二类分布于室周灰质和中央灰质的深层,第三类主要分布于中央灰质的浅层、下托、海马旁回和内嗅区皮质的Ⅱ、Ⅲ层,第四类常见于顶盖与下托,第五类位于顶盖、海马、齿状回、海马旁回和内嗅区皮质的第Ⅴ层;下托和内嗅区的阳性神经细胞数为(7.20±1.23)/mm2 .实验组上述部位脑组织巢蛋白呈阳性表达,平均灰度值为133.03±22.28,上述5类细胞的密度增加,下托和内嗅区的强阳性神经细胞数为(10.50±1.43)/mm2.两组平均灰度值和阳性神经细胞数均有显著差异(P《0.05).与对照组相比,实验组小鼠室管膜上皮细胞增生;中央灰质的浅层、海马旁回和内嗅区皮质第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ层内出现了第二类细胞;海马锥体细胞层第三类细胞增加;顶盖和下托内第四类细胞增加. 结论:吗啡可能通过促进小鼠室管膜上皮细胞、中央灰质、室周灰质及海马结构巢蛋白的表达促进神经细胞的增殖、分化与迁移.
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丝聚蛋白与相关皮肤病发病机制的研究进展
丝聚蛋白通过参与角质形成细胞的终末角化过程,在表皮屏障中发挥重要作用.中间丝聚合蛋白基因突变引起蛋白表达下降,导致多种过敏性疾病.丝聚蛋白基因突变导致特应性皮炎,也是欧洲和亚洲人种寻常型鱼鳞病的主要诱发因素.丝聚蛋白基因与特应性皮炎发病的婴儿期或早期儿童期关系密切,而与晚期儿童期和成人期无关.有研究发现,小鼠体内缺氧诱导因子引起丝聚蛋白表达降低,提示丝聚蛋白可能不是疾病的单一致病因素.
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中间丝相关基因突变与皮肤病关联性的研究进展
中间丝相关蛋白是皮肤屏障中的一种重要的结构蛋白,对外界各种有害物质的入侵起到防御作用.中间丝相关蛋白相关基因突变或先天性缺陷,将导致这些蛋白质的异常表达,从而导致一系列以皮肤屏障功能损伤为特征的皮肤病发生.研究发现,中间丝相关蛋白基因突变与特应性皮炎以及寻常性鱼鳞病发病有明显的相关性;中间丝相关蛋白基因无义突变可能会降低镍接触性皮炎的发病年龄和增加对镍的敏感性;中间丝相关蛋白基因突变可能与斑秃、先天性厚甲综合征有关.总之,中间丝相关蛋白基因突变与多种皮肤疾病的发生有关联性,但目前中间丝相关蛋白基因突变是否为某一皮肤病的特征性致病因子仍需进一步研究.
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中间丝蛋白与特应性皮炎皮肤屏障功能
特应性皮炎的病因复杂,发病机制尚未明确,可能是遗传、环境、皮肤屏障功能缺陷及免疫相互作用的结果.中间丝蛋白基因是表皮分化复合物基因簇的成员之一,与细胞膜形成及表皮终末分化密切相关.中间丝蛋白基因突变是特应性皮炎发病的重要易患因素之一,中间丝蛋白的减少和缺失,可能是引起特应性皮炎等十燥性皮肤病的主要原因.
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皮肤屏障功能研究进展
皮肤屏障主要由角化包膜和脂质膜、中间丝聚合蛋白、角蛋白、角化桥粒、板层小体和角质层角质形成细胞问质、紧密连接等组成,防止水分的丢失及阻止外界的侵害,维持机体内稳态.基因突变、变应原、微生物、紫外线等因素共同作用下,能导致皮肤屏障结构、代谢及功能的异常,引起鱼鳞病、特应性皮炎等皮肤病.阐明皮肤病与屏障结构及功能异常联系,指导开发有效的诊疗和预防措施.
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特应性皮炎的研究进展
特应性皮炎,通常发生于婴幼儿期,其主要特征是皮肤瘙痒.伴随症状为哮喘,过敏性鼻炎等.在世界范围内,儿童发病率在10%～20%之问,并且具有明显的家族聚集性.近年来此病的发病率有所增加.中间丝相关蛋白是一个在表皮屏障功能中起关键作用的蛋白,研究表明,中间丝相关蛋白基因所发生的突变存在于患有寻常性鱼鳞病的欧洲家庭中,而且也是特应性皮炎一个重要的易感因素.
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中间丝聚合蛋白基因多态性与特应性皮炎发病及临床表型的相关性
目的 探讨中间丝聚合蛋白(FLG)基因多态性与特应性皮炎(AD)发病及临床表型的相关性.方法 采用问卷调查的形式收集261例AD患者伴发过敏性鼻炎、哮喘病史和疾病严重度评分等资料,对部分患者进行混合食物过敏原和混合吸人性过敏原筛选、血清总IgE抗体和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平检测.采用重叠PCR和DNA测序法对上述AD患者和276例健康对照FLG基因3号外显子17个多态性位点(R444G、T454A、P478S、H519N、D836D、S1482Y、A1805V、R1891Q、1961Q、S2166S、Y2194H、H2330H、D2339N、S2366T、E2398Q、K2444E、E2652D)进行基因分型.结果 二项逻辑回归分析和卡方检验未发现17种FLG多态位点与AD发病相关(均P＞0.05).H519N与AD伴发哮喘相关(x2=8.680,P=0.011),AA基因型可增加AD患者发生哮喘的风险(P=0.004,OR=1.061,95％ CI 1.016 ～ 1.109).S2366T和K2444E与AD患者食物敏感相关(x2值分别为6.520和6.121,P值分别为0.038和0.047),S2366T的GG+ GC基因型(P=0.012,OR=1.396,95％CI 1.054～1.849)和G等位基因(P=0.037,OR=1.350,95％CI 1.008～ 1.807)可提高AD患者食物敏感的风险.K2444E的AA+ AG基因型(P=0.013,OR=1.393,95％ CI 1.049 ～ 1.850)和G等位基因(P=0.028,OR=1.380,95％ CI 1.025 ～ 1.857)可提高AD患者食物敏感的风险.结论 中国汉族人群FLG基因多态性可能是一些AD相关临床表型的危险因素,H519N可能与AD伴发哮喘相关,S2366T和K2444E则可能与AD伴食物敏感相关.
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细胞骨架蛋白基因转录与小分子促小鼠胚胎干细胞定向分化神经元样细胞的相关性
目的:探索细胞骨架蛋白基因转录是否涉及全反式维甲酸(RA)促胚胎干(ES)细胞早期定向分化神经元样细胞,以此构建快速评价药物对ES细胞定向分化神经元的促进或抑制作用.方法:采用悬滴培养法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体,进而贴壁向神经细胞分化.利用RT-PCR法评价神经元呈特征性表达的一类细胞骨架蛋白基因微管相关蛋白(Mtap2)、神经丝(Nefm)和微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)转录水平,作为RA促ES细胞定向分化神经元指标,结合光镜和免疫荧光法鉴定神经细胞的形成,由此构建快速评价体系.并在此基础上进一步评价合成化合物库内6个小分子对细胞骨架蛋白基因转录的影响.结果:RA诱导ES细胞定向分化神经元过程, Mtap2和Nefm转录水平均呈上调趋势,其中以Mtap2为甚,增加了1.27倍,并与同期细胞表型改变相一致,但β-tubulin Ⅲ无明显变化.6个合成小分子均使Mtap2转录受到抑制,但Nefm转录水平有不同程度上调,1号和3号化合物尤甚,分别增加了1.4和1.2倍,该上调作用与同期细胞表型改变不尽一致.结论:RA诱导ES细胞定向分化神经元早期,Mtap2和Nefm转录水平均呈上调趋势,其中Mtap2的表达与否与早期细胞表型改变相一致.
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巢蛋白在足突广泛融合的肾小球中表达下调及与蛋白尿程度的相关性
目的 观察中间丝蛋白类的巢蛋白(nestin)在足突广泛融合的肾小球中的表达及其与足突病变动态过程和蛋白尿产生的关系.方法 免疫组化法检测nestin在人正常肾组织及微小病变肾组织中的表达.构建氨基核苷嘌呤霉素肾病大鼠模型,应用免疫组化、荧光实时定量PCR、Western印迹法检测注射嘌呤霉素后第1、4、10、20天大鼠肾小球中nestin的分布与表达;电镜观察肾脏足细胞改变,测定尿蛋白量(24 h).分析nestin的变化与蛋白尿的相关性.结果 免疫组化显示nestin在人类微小病变肾小球中的表达较正常组织显著下调(0.93±0.08比1.65±0.12,P<0.05).在嘌呤霉素损伤足细胞早期,肾小球nestin的表达曾有一过性增加(mRNA和蛋白水平分别为对照组的1.23倍和1.48倍,P<0.05),随后持续下降.nestin的mRNA水平在嘌呤霉素注射后第4天时降至对照组的35.8%;第10天时为对照组的12.1%(均P<0.01);病变好转后开始上升,恢复为对照组的65.8%(P<0.05).Western印迹检测nestin蛋白改变也有类似的趋势,嘌呤霉素注射后第4天,nestin蛋白水平有所下降,为对照组的77.0%(P<0.05);至大量蛋白尿的第10天,nestin蛋白水平仅为对照组的58.0%(P<0.05);而随着病变的恢复,嘌呤霉素注射后第20天时nestin蛋白量恢复为对照的83.4%.Pearson相关分析结果显示,注射嘌呤霉素后nestin mRNA(r=-0.667,P<0.05)及蛋白(r=-0.621,P<0.05)表达与尿蛋白量(24 h)均呈负相关.结论 在以足突广泛融合为特征的肾脏病变中,肾小球中间丝蛋白nesfin表达显著减少,并与蛋白尿程度呈负相关,提示nestin可能参与了足细胞形态和功能的维持.
