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人胚神经干细胞植入脑损伤大鼠的存活和分化状态
背景:神经干细胞的发现为中枢神经系统损伤修复带来希望,但脑损伤后的内部环境对神经干细胞存活和分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察大鼠脑液压冲击伤后植入的人胚神经干细胞存活情况和分化状态.设计:开放性实验.单位:广东省中医院神经外科,北京市神经外科研究所.材料:实验于2002-09/2003-03在北京市神经外科研究所神经干细胞室完成.选取SD雌性大鼠24只(购自中国医学科学院实验动物研究所,动物质量合格证号:SCXK(京)2002-2003),7周龄,体质量(250±10)g.8周龄流产胎儿大脑(产妇及其家属均同意提供),流产过程中B超监测胎儿的存活状况.BrdU单克隆抗体(Sigma公司),兔抗巢蛋白多克隆抗体(Chemicon 公司),鼠抗微管相关蛋白2单克隆抗体(Neomarkers 公司),兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(Biogenex 公司).方法:①取8周龄流产胎儿大脑皮层细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.②大鼠制作液压冲击伤模型.大脑皮质运动感觉区骨窗位置:以前囟为零点,向后2.5 mm,中线右3.0 mm.液压冲击参数:冲击压力0.3 Mpa,冲击时间25 ms,冲击次数为1次.③伤后24 h在损伤区移植标有BrdU的人胚神经干细胞,1周和4周后处死大鼠,邻片行BrdU/微管相关蛋白2和BrdU/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:①人胚神经干细胞移植后的存活及迁移.②人胚神经干细胞移植后的分化.结果:①BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1,4周均可见其存活并向周围迁移,且移植后4周迁移的范围更广.②移植后1周,皮质颗粒层和皮层下均见较多的BrdU阳性细胞,且BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞;移植后4周,BrdU阳性细胞数明显减少,脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞能够存活于脑损伤区域,移植后逐渐分化为星形胶质细胞,且易被内皮吞噬细胞所消化.提示免疫排斥反应可能影响人胚神经干细胞的存活.
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骨髓源性神经干细胞诱导分化及移植治疗颅脑损伤
目的:观察体外诱导感人骨髓基质细胞向骨髓源性神经干细胞的分化情况,探讨应用骨髓源性神经干细胞移植治疗脑损伤的可行性.方法:实验于2005-01/10在珠江医院神经外科实验室完成.①选取清洁级SD大鼠6只,随机数字表法分为脑损伤组、假手术组,3只/组.以3名健康成人自愿捐献的骨髓作为实验移植骨髓源性神经干细胞的来源."CYTOKINE·神经干细胞培养基"由珠江医院神经外科实验室调配,专利申请号:ZL02134314.4.②抽吸骨髓,密度梯度离心法获取骨髓基质细胞,以"CYTOKINE·神经干细胞培养基"+体积分数0.1的胎牛血清诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化,倒置相差显微镜追踪观察细胞的形态变化.免疫荧光细胞化学鉴定Nestin、神经元特异性烯醇化酶、胶质酸性纤维蛋白的表达情况.③脑损伤组大鼠以自由落体撞击法建立脑损伤模型,假手术组只作开颅手术,未进行自由落体撞击.造模24 h后,两组大鼠尾静脉移植3×106以Dio标记的诱导7 d的细胞,荧光显徽镜检测移植细胞的存活和迁移.结果:①细胞形态变化观察:原代培养的骨髓基质细胞增殖迅速,诱导分化7～10 d可发现典型的细胞团.②抗原的表达情况:成功诱导人骨髓基质细胞向神经细胞方向分化,并表达神经前体细胞特异性标志Nestin、胶质酸性纤维蛋白、神经元特异性烯醇化酶.③移植细胞的存活和迁移检测:人骨髓源性神经干细胞能够在大鼠脑内存活,并向脑损伤区定向迁移,主要分布于损伤灶周围.脑损伤区对侧及假手术组则少见移植细胞的迁移分布.结论:人骨髓基质细胞在合适的条件下能被诱导分化为骨髓源性神经干细胞,可存活并迁移至大鼠脑内并参与脑损伤的修复.
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细胞骨架蛋白基因转录与小分子促小鼠胚胎干细胞定向分化神经元样细胞的相关性
目的:探索细胞骨架蛋白基因转录是否涉及全反式维甲酸(RA)促胚胎干(ES)细胞早期定向分化神经元样细胞,以此构建快速评价药物对ES细胞定向分化神经元的促进或抑制作用.方法:采用悬滴培养法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体,进而贴壁向神经细胞分化.利用RT-PCR法评价神经元呈特征性表达的一类细胞骨架蛋白基因微管相关蛋白(Mtap2)、神经丝(Nefm)和微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)转录水平,作为RA促ES细胞定向分化神经元指标,结合光镜和免疫荧光法鉴定神经细胞的形成,由此构建快速评价体系.并在此基础上进一步评价合成化合物库内6个小分子对细胞骨架蛋白基因转录的影响.结果:RA诱导ES细胞定向分化神经元过程, Mtap2和Nefm转录水平均呈上调趋势,其中以Mtap2为甚,增加了1.27倍,并与同期细胞表型改变相一致,但β-tubulin Ⅲ无明显变化.6个合成小分子均使Mtap2转录受到抑制,但Nefm转录水平有不同程度上调,1号和3号化合物尤甚,分别增加了1.4和1.2倍,该上调作用与同期细胞表型改变不尽一致.结论:RA诱导ES细胞定向分化神经元早期,Mtap2和Nefm转录水平均呈上调趋势,其中Mtap2的表达与否与早期细胞表型改变相一致.
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全反式维甲酸及银杏提取物对神经干细胞分化的影响
摘要 目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)、银杏提取物(Egb)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化为胆碱能神经元和多巴胺能神经元的作用.方法 取第3代NSCs诱导分化,试验分为4组:ATRA组(10-8mol/L)、Egb组(2 mg/L)、ATRA(10-8mol/L)+Egb组(2 mg/L)和空白对照组;免疫细胞化学染色检测神经微管相关蛋白(MAP2)、乙胆碱酯酶(AchE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率.结果 ATRA组诱导神经干细胞分化为AchE阳性和TH阳性神经元的百分率分别为26.32%±3.62%和12.02%±2.78%;Egb组分别为42.93%±3.08%和18.13%±1.74%;ATRA+Egb组分别为43.32%±5.60%和13.03%±2.54%;空白对照组分别为27.68%±2.51%和5.74%±1.81%.结论 ATRA和Egb均可促进NSCs 向TH阳性神经元分化,Egb还可促进NSCs 向AchE阳性神经元分化,ATRA和Egb联用无协同效应.
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17β-雌二醇对神经干细胞分裂分化作用的观察
目的探讨雌激素对神经干细胞分裂分化的作用.方法大鼠神经干细胞培养模型加入剂量为10 mg/L 17β-雌二醇和10 mmol/L BrdU,分别在培养4、12 h取出细胞,进行免疫细胞化学标记.结果培养4 h,雌二醇组单位面积细胞总数和BrdU标记细胞与对照组比较差别无显著性(P=0.259, P=0.067),培养12 h,雌二醇组细胞BrdU胞核着色变浅,胞浆有着色,有40%的细胞可见明显突起,单位面积的细胞总数较对照组无显著性改变(P=0.06), BrdU标记细胞数目减少(P=0.003), 提示分裂细胞减少.另一方面,培养12 h时的雌二醇处理组BrdU免疫荧光阳性细胞的光密度(OD)显著高于对照组(P<0.01).结论 17β-雌二醇可以抑制大鼠神经干细胞分裂,促进神经干细胞分化.
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N-硝基-L-精氨酸对人胚胎神经干细胞增殖的作用
目的:探讨一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)对人胚胎神经干细胞的增殖作用.方法:取4月龄(120±15d)正常孕妇引产胎儿的大脑皮质组织分离细胞,用无血清的条件培养基,培养原代神经干细胞并用间接免疫荧光化学法进行鉴定.第5天时,在培养基中加入不同浓度的L-NNA,继续培养24 h后,用Griess还原法检测培养液中一氧化氮含量；用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定细胞活力.结果:加入不同浓度L-NNA24 h后,培养液中一氧化氮量随L-NNA浓度的增高而降低,且显著低于对照组(P＜0.05).MTT法显示经L-NNA作用后的神经干细胞活细胞数较对照组明显增加(P＜0.05),并呈浓度相关性.结论:L-NNA对培养状态下的人胚胎神经干细胞增殖有促进作用.
