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阿尔茨海默病尿神经丝蛋白检测方法的建立及其临床意义
目的 研制检测尿中AD7C-NTP诊断试剂盒,并分析评价其在诊断AD中的临床应用价值.方法 固相法合成具有免疫原性的AD7C-NTP抗原决定簇多肽片段,通过免疫动物、制备抗体、配对筛选,以小鼠抗ADTC-NTP抗体作为包被抗体,以生物素标记兔抗AD7C-NTP抗体和辣根过氧化物酶标记亲和素建立ELISA检测尿AD7C-NTP的方法;并用以检测和分析121例AD患者与118名同龄健康人清晨中段尿液中AD7C-NTP的水平差异.结果 经过鉴定,小鼠抗AD7C-NTP抗体的ELISA检测效价为1:8 000,兔抗AD7C-NTP抗体的ELISA检测效价为1:32 000;WB检测人脑标本中抗AD7C-NTP抗体的相对分子质量为41 000.自建ELISA检测AD7C-NTP的灵敏度为0.2μg/L,线性范围为0-10μg/L,正常参考值1.5μg/L,平均回收率为100.2%,批内CV为3.8%和4.5%,批间CV为7.6%和6.8%.AD组尿AD7C-NTP[2.25(0.43-8.62)μg/L]高于健康对照组[0.82(0.47-2.77)μg/L,P<0.01],AD组和健康对照组阳性率分别为89.3%和15.3%,AD7C-NTP检测的敏感度为89.3%、特异度为84.7%.结论 用自行设计合成的多肽片段免疫动物,成功制备了抗AD7C-NTP抗体,初步建立的尿AD7C-NTP的ELISA检测方法精密度和灵敏度高,有可成为临床诊断AD的辅助手段.
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孕鼠补充牛磺酸促进生长受限胎鼠神经元与神经干细胞增殖的佳时机
目的：探讨孕鼠补充牛磺酸促进胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）胎鼠神经元及神经干细胞增殖的佳时机。方法25只Sprague-Dawley孕鼠随机分为5组（每组5只），A组为对照组，B~E组均为FGR组采用全程低蛋白饮食法建立FGR胎鼠模型，且C~E组分别于妊娠第9、11、15天补充牛磺酸300 mg/（kg·d）。孕鼠自然分娩后，称量新生鼠出生体重，低于对照组新生鼠平均出生体重2个标准差，判定为FGR。每组5窝新生鼠，每窝随机抽取2只，每组10只，采用免疫组织化学方法检测新生鼠脑组织增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、脂肪酸结合蛋白7（fatty acid binding protein 7，FABP7）阳性表达情况。统计学方法采用单因素方差分析、LSD检验。结果 A、B、C、D、E组新生鼠平均出生体重分别为（6.61±0.45）、（4.65±0.23）、（5.37±0.17）、（5.74±0.21）和（5.00±0.24） g，B组低于A组（t=2.447），D和E组均高于B组（t值分别为2.306和2.306），D组高于C和E组（t值分别为2.306和2.306），差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。新生鼠脑组织PCNA阳性表达主要位于细胞核内；A、B、C、D、E组每高倍镜视野（×400）PCNA阳性细胞个数分别为（31.03±5.38）、（46.49±4.38）、（59.65±5.37）、（67.76±5.84）和（53.53±6.94）个，B组多于A组（t=2.110），C、D和E组PCNA均多于B组（t值分别为2.110、2.110和2.131），D组多于C和E组（t值分别为2.101和2.110），差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。新生鼠脑组织FABP7阳性表达主要位于细胞质中，A、B、C、D、E组的积分吸光度值分别为451733.1±141452.3、207232.2±60525.2、333766.6±68412.1、380647.4±131145.9、278967.1±127630.7，B组低于A组（t=3.165，P=0.000），C、D、E组均高于B组（t值分别为5.272，7.132和2.950，P值均＜0.05），D组高于C组，但差异无统计学意义（t=1.953，P＞0.05），D组高于E组，差异有统计学意义（t=4.182，P＜0.05）。结论孕鼠补充牛磺酸可促进FGR胎鼠神经元和神经干细胞增殖，在妊娠第11天时补充效果显著，可能发挥促进脑发育的佳效应。
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氨基末端脑利钠肽前体在室间隔缺损合并心力衰竭诊断中的价值
目的探讨血浆氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)水平在室间隔缺损合并心力衰竭(简称心衰)诊断及心功能评估中的价值.方法 51例室间隔缺损患儿,按照小儿心衰改良Ross标准分为0～2分(无心衰)、3～6分(轻度心衰)、7～12分(中-重度心衰)三组;对照组15例.应用ELASA方法测定血浆NT-proBNP浓度.同时测定左室舒张末期容量指数(left ventricular end diastolic volume index,LVEDVI)、左室收缩末期室壁应力(left ventricular end systolic wall stress,LVESWS)、心率校正的平均周径缩短速率(heart rate corrected mean velocity of circumferential fiber shortening,mVcFc)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)、心肌收缩力(contractility index,Con)等超声心动图指标.结果 (1)血浆NT-proBNP水平与临床评分之间呈明显正相关(r＝0.75,P＜0.01),中-重度心衰组[(2061±908)fmol/ml]高于轻度心衰组[(810±335)fmol/ml];轻度心衰组高于无心衰组[(309±68)fmol/ml];但是无心衰组与正常对照组间[(275±62)fmol/ml]差异无统计学意义.(2)血浆NT-proBNP水平与LVESWS、 LVEDVI呈正相关;与LVEF、LVFS、Con、mVcFc等无明显相关性.(3)血浆NT-proBNP水平≥400 fmol/ml的情况下诊断充血性心衰的敏感度为89.3%,特异度为91.2%,ROC曲线下面积为0.944.结论血浆NT-proBNP水平可用于室间隔缺损合并心衰患儿心功能的评估,可以用于该类患儿心衰的诊断及分度.
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小鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及其机制研究
目的探讨小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化的影响及其机制.方法体外分离、培养BABL/c胎鼠NSCs,利用NSCs向神经细胞分化模型,用感染复数(MOI)为1的含LacZ报告基因的重组MCMV毒株RM461进行感染,通过免疫组化、流式细胞术和RT-PCR检测MCMV感染后Nestin、GFAP和NSE阳性细胞比率及对神经干细胞分化相关信号分子Wnt-1和neurogenin 1(Ngn1)基因表达的影响.结果体外分离培养的NSCs,神经干细胞特异性标志Nestin表达强阳性,并可进一步分化为GFAP阳性的星形胶质细胞和NF-200、NSE阳性的神经元.当NSCs分化培养2 d,感染组和未感染组Nestin阳性细胞分别为(62.2±1.8)%和(37.2±2.4)%(t=4.62,P＜O.01),差异有统计学意义;而GFAP阳性细胞的比例分别为(37.4±1.6)%和(50.3±1.8)%(t=9.89,P＜0.01),NSE阳性细胞的比例分别为(8.9±0.8)%和(23.4±1.3)%(t=5.09,P＜0.01),差异均有统计学意义.感染组和未感染组Wnt-1基因的相对表达量分别为0.14±0.03和0.32±O.04(t=7.21,P＜0.01),Ngn1基因的相对表达量分别为0.09±0.01和0.21±0.02(t=10.73,P＜0.01),差异均有统计学意义.结论(1)CMV可抑制NSCs分化,这可能是CMV致脑发育异常的重要机制;(2)CMV感染可抑制Wnt-1和Ngn-1的基因表达而影响NSCs分化,人为调控这两条通路可能为探寻防治CMV感染致脑发育异常的方法提供新策略.
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肺癌组织神经生长导向因子Slit2蛋白表达及其临床意义的研究
目的:研究肺癌组织中神经迁移导向因子Slit2蛋白的表达及其临床意义.方法:免疫组织化学法检测56例肺癌组织中Slit2蛋白的表达及微血管密度(microvessal density, MVD).结果:56例肺癌标本中,Slit2阳性率为76.8%,且其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、组织分化程度及临床TNM分期密切相关,P<0.01;而与患者性别和病理类型无关,P>0.05.Slit2蛋白表达与肺癌组织中MVD呈显著正相关,r=0.732,P<0.001.结论:肺癌组织中Slit2表达在肺癌生长和血管生成中起重要作用,其有可能成为反映肺癌进展的指标和抗肿瘤治疗的重要靶点.
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舞蹈病家系临床、影像学特征及基因突变分析
目的明确一个无明显痴呆的舞蹈病家系的临床、影像学特征及IT15、DRPLA、JPH3、TBP基因突变情况.方法对5例已发病患者的临床及脑影像学特征进行分析;用聚合酶链反应技术、8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及直接测序等方法,对18名家系成员的IT15、DRPLA、JPH3、TBP基因的三核苷酸(CAG/CTG)重复序列进行分析.结果 5例患者主要表现为舞蹈样不自主运动;3例患者头颅磁共振成像无明显尾状核萎缩,其中1例头颅单光子发射计算机断层显像(SPECT)提示双侧基底节血流受损,比健康人血流灌注减少;检测到9例(5例患者,4例症状前患者)分别有一(CAG)n重复拷贝数大于40次的IT15基因,无DRPLA、JPH3、TBP基因的突变.结论根据临床和影像学特征该家系在临床上不能确诊为亨廷顿舞蹈病,但经基因突变分析确定了IT15基因中(CAG)n重复拷贝数的异常扩展导致该家系发生了亨廷顿舞蹈病.
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食蟹猴年龄相关的运动功能减退及其与纹状体多巴胺转运体的关系
目的 研究食蟹猴老化过程中运动行为和脑内纹状体多巴胺系统功能变化及两者之间的相关关系.方法 选取4岁、10岁和15岁3个年龄组的健康食蟹猴共29只,利用计算机化的网络摄像头视频检测系统和行为分析软件连续采集和分析每个动物8 h随意运动活动总量,各年龄组分别选取4只动物用多巴胺转运体(DAT)配体99mTc-TRODAT-1结合单光子发射体层摄影术(SPECT) 显像观察脑内纹状体多巴胺转运体放射性摄取率的变化.结果 在4岁、10岁和15岁年龄组,8 h随意运动活动总量(×106)分别为5.00±1.93,3.28±1.02,2.79±0.67,在10岁和15岁较之4随年龄组分别降低了34.50%和55.71% ( P＜0.05, P＜0.01),但此两个年龄组运动活动总量无显著差异(P＞0.05);纹状体99mTc-TRODAT-1 放射性摄取率分别为2.98±0.08, 2.56±0.12 和 2.27±0.35,10岁和15岁较之4随年龄组分别降低了14.00% 和25.60%,但仅4岁与15岁年龄组存在显著相关关系(P＜0.01).二者均随着年龄的增长呈逐渐减低的趋势,直线回归分析显示两者分别与年龄呈负相关关系 (r=-0.57, P=0.001; r =-0.86, P＜0.01).8 h随意运动活动总量与纹状体99mTc-TRODAT-1 放射性摄取率呈显著的正相关关系 (r=0.70, P＜0.05).结论 正常食蟹猴老化过程中,脑内多巴胺神经系统功能的减退伴随着运动行为的减少,两者之间的相关关系进一步佐证了运动功能的减退可能是由于纹状体内多巴胺神经元功能减退所致.
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脊髓性肌萎缩症运动神经元生存基因2拷贝数与临床表型的关系
目的探讨运动神经元生存基因2(SMN2)拷贝数与临床表型的关系,进一步阐明脊髓性肌萎缩症(SMA)的发病机制.方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术特异性扩增50名健康人、51例临床确诊SMA患者SMN2基因7号外显子及其邻近区域,并以已确定只有3个拷贝的SMN2样品作为标准对照.结果 50名健康人中有2名SMN2拷贝数为0;51例患者中SMN2拷贝数为1、2、3、4的例数分别为8、22、16、5例;患者两性之间SMN2拷贝数差异无统计学意义;SMN2拷贝数与病情严重程度之间呈负相关(r=0.682,P=0.000);24例死亡患者中,具有1及2个拷贝SMN2患者的平均生存时间分别为13.8及22.7个月,两组间生存时间及生存率的差异具有统计学意义(P<0.01).结论对于SMA患者,SMN2可能对SMN1基因缺失起到一定的代偿作用,SMN2拷贝数可作为判断患者预后的一个指标.对患者SMN2拷贝数的研究也为基于增加SMN2全长功能蛋白表达的基因治疗策略提供了理论依据.
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泛素依赖的蛋白水解通路在转染脊髓小脑性共济失调3型基因的PC12细胞中的定位及作用
目的分析泛素依赖的蛋白水解通路(UPP)在转染了脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)基因的PC12细胞中的定位及作用.方法构建含有SCA3正常与突变基因在内的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFPC1-ataxin3 Q28、pEGFPC1-ataxin3 Q84)后转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞,转染后24、72、120 h免疫荧光检测ataxin3、泛素(ubiquitin)、蛋白水解酶核心成分20S及热休克蛋白40、70(Hsp40、Hsp70)在细胞内的分布情况,观察其与核内包涵体(INIs)共定位的情况;给予蛋白水解酶抑制剂lactacystin (10 μmol/L)后台盼蓝染色观察细胞存活率的变化.结果正常蛋白ataxin3 Q28于胞质、胞核广泛分布,而突变蛋白ataxin3 Q84多集中于胞核内;ubiquitin在两组的表现与目的蛋白一致.随着时间的延长20S及Hsp40、Hsp70细胞核内与INIs共定位,形成密集荧光.正常对照组与突变组120 h时INIs形成数目在Hsp40组分别为18.40±3.36、75.00±5.09;Hsp70组分别为15.43±3.05、74.75±4.99;20S组分别为4.20±1.92、92.61±3.65,统计学处理正常对照组与突变组之间P值分别为0.000、0.043、0.027,差异有统计学意义;突变组给予lactacystin后细胞死亡明显增加,前后对比120 h时细胞死亡数目分别为77.50±3.33、94.67±1.82,统计学处理前后组之间P值为0.000,差异有统计学意义.结论 UPP通路中ubiquitin、20S以及重要的辅助成分Hsp40、Hsp70与ataxin3以及由此形成的INIs紧密地共定位,抑制UPP通路中的20S活性导致细胞死亡明显增加,推测UPP在SCA3发病机制中发挥重要的作用,对UPP的干预有可能成为SCA3治疗的一个途径.
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耐药性癫(癎)患者脑组织中热休克蛋白27相关蛋白1的表达
目的 研究热休克蛋白27相关蛋白1(heat shock 27 000 associated protein 1,HSPBAP1,GenBank:AK096705)在耐药性癫(癎)患者脑组织中的表达,探讨其在耐药性癫(癎)发病机制中的作用.方法 从重庆医科大学附属第一医院神经内科建立的耐药性癫(癎)脑库中随机抽取36例耐药性癫(癎)患者术后脑组织,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和免疫组化法对HSPBAP1的表达进行检测,并与8例对照进行比较.结果 耐药性癫(癎)患者脑组织中HSPBAP1 mRNA的相对表达量是对照组的34.11倍;HSPBAP1蛋白在耐药性癫(癎)患者颞叶(0.0507±0.0003,P＜0.01)和海马(0.0488±0.0196,P＜0.05)中的表达量,与对照组相同部位比较明显增加.结论 耐药性癫(癎)患者脑组织中HSPBAP1表达增高,能抑制热休克蛋白27(HSP27)的神经元保护作用,可能是导致神经元凋亡及海马苔藓纤维发芽的一个重要原因.
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帕金森病模型鼠黑质α-突触核蛋白表达升高并集聚
目的观察低剂量1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)对小鼠黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达的影响.方法 C57BL小鼠腹腔注射MPTP 20 mg/kg体重,每周注射1次连续3周,观察小鼠行为改变,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western 印迹法、免疫组化染色检测α-突触核蛋白表达,荧光双标染色观察多巴胺能神经元内α-突触核蛋白聚集.结果与注射生理盐水组相比,注射MPTP组小鼠出现暂时性躯干震颤、竖毛、动作减少等;α-突触核蛋白基因表达百分比(79.5 %±0.8%,生理盐水组为19.2%±3.3%,P<0.05)及蛋白表达百分比(82.2%±4.1%,生理盐水组为18.5%±1.0%,P<0.05)均明显增加;黑质部酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数减少,α-突触核蛋白阳性细胞数增加;α-突触核蛋白与硫磺素S、TH与硫磺素S复合定位染色的阳性细胞数均升高.结论低剂量MPTP可诱导小鼠行为改变,黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白表达升高,并出现蛋白聚集.
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Lewy小体病的临床病理学研究
目的为探讨Lewy小体病的病理特点,报道1例80岁,女性,以进行性痴呆、肌肉强直为特征,病理学上确认为Lewy小体病的国人尸体解剖病例.方法临床诊断为老年性痴呆的尸检脑组织标本,应用HE染色、神经系统特殊染色、免疫组织化学染色(ABC法)和电子显微镜对脑的病理形态学、Lewy小体的分布和α-共核蛋白异常积聚进行了研究.结果脑病理变化特征:①中脑黑质、桥脑蓝斑和延髓迷走神经背核大量神经细胞脱落,星形胶质细胞增生,残存的神经细胞胞浆内有典型的脑干型Lewy小体;②大脑皮质,尤其在扣带回、岛叶、海马、海马旁回、内嗅叶皮质和杏仁核等处有大量皮质型Lewy小体存在;③海马CA2/3、海马旁回、内嗅叶皮质出现局限性空泡样变性和大量Lewy突起苔丝变性;④所有Lewy小体对α-共核蛋白呈强阳性表达;⑤无阿尔茨海默病样老年斑,神经原纤维缠结等病理变化.结论 Lewy小体病是一组独立的中枢神经系统变性疾病,其病理特征与阿尔茨海默病的病理变化有明显差异.Lewy小体和Lewy突起苔丝变性对泛素化蛋白呈阳性表达.α-共核蛋白可能是构成Lewy小体的主要成分.本例属单纯型弥漫性Lewy小体病.
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帕金森病患者脑标本黑质、纹状体内多巴胺转运体蛋白的表达
目的 观察帕金森病(PD)患者脑标本黑质、纹状体多巴胺转运体(DAT)的表达.方法以免疫放射自显影显示DAT在黑质、纹状体的分布.结果正常人脑标本DAT强标记信号分布于黑质、壳核和尾状核.在PD患者脑标本,正常分布于壳核的DAT几乎均消失;尾状核DAT降低以背外侧部为主;黑质DAT标记减少程度轻于壳核、尾状核,以黑质腹侧区和外侧区为主.定量分析发现DAT强度在壳核比对照组降低90.9%(P<0.01),在尾状核背外侧降低66.7% ( P<0.01);所分析黑质5个亚区的腹侧区和外侧区DAT表达降低明显,标记强度比对照组分别下降50.0%和35.9% (P<0.05, P<0.01);另3个亚区有降低趋势,差异无统计学意义.结论 DAT在PD患者脑标本壳核及尾状核表达显著降低,为临床应用DAT配基显像技术诊断PD提供了直接的形态学依据.
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二肽基肽酶-6基因多态和散发性肌萎缩侧索硬化发病风险的相关性
目的 探讨中国人二肽基肽酶-6(DPP6)基因中的单核苷酸多态位点rs10260404与散发性肌萎缩侧索硬化(SALS)易患性是否有关.方法 来自中国汉族人群的58例患者与52名健康对照分别提取样本外周血基因组DNA,采用不对称PCR方法扩增包含目标单核苷酸多态位点在内的片段,用高分辨熔解法完成非标记探针的基因分型.结果 SALS患者与健康对照之间rs10260404位点的等位基因频率(SALS组:C:12.94%,T:87.06%;健康对照组:C:10.58%,T:89.43%)差异无统计学意义(χ2=0.29,OR=1.256,95% CI 0.549～2.872,P>0.05).结论 我们未发现DPP6基因中rs10260404位点和中国人SALS的致病风险相关,这可能和ALS本身复杂的遗传异质性有关,但有必要进一步增加病例数以证实.
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IT15基因CAG重复次数与亨廷顿病临床表型的相关性
目的 探讨IT15基因CAG重复次数与亨廷顿病发病年龄、认知及情感障碍等临床表型之间的关系.方法 采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测29例患者IT15基因的CAG重复次数.采用亨廷顿病统一评定量表(UHDRS)和简易智能精神状态检查量表(MMSE)对患者的运动、智能、精神和执行能力进行评分.结果 29例患者的IT15基因的基因型均为杂合子,致病CAG重复次数为40～62,正常CAG重复次数为13～28次.致病CAG重复次数与发病年龄之间呈负相关(r=-0.539,P＜0.01);总体执行能力与精神状态评分(r=-0.642,P＜0.01)、运动评分(r=-0.766,P＜0.01)呈负相关,与MMSE呈正相关(r=0.500,P＜0.01).结论 IT15基因致病CAG重复次数只能解释约36%的发病年龄的变化,不能作为预测亨廷顿病发病年龄的独立因子.运动症状、精神和智能障碍的加重,严重影响患者的总体执行能力.
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以嗜睡为突出表现的抗Ma-2抗体相关脑炎
目的 分析抗Ma-2抗体相关脑炎患者睡眠特点,探索睡眠障碍的机制.方法 回顾我院确诊的以过度嗜睡为首发症状的抗Ma-2抗体相关脑炎1例,分析其临床、影像、多导睡眠监测、脑脊液、病理检查等特点,结合文献进行讨论.结果 本例以嗜睡为突出症状,伴记忆力减退、精神行为异常、行走不稳等,磁共振成像提示边缘系统、下丘脑、上位脑干损害,多导睡眠监测表现为发作性睡病样特点及快速眼动期睡眠行为障碍,脑脊液下丘脑分泌素水平正常(186 pg/ml),血及脑脊液抗Ma-2抗体阳性,结肠组织病理检查为淋巴瘤,确诊为淋巴瘤合并抗Ma-2抗体相关脑炎.结论 抗Ma-2抗体相关脑炎的睡眠障碍可以表现为过度嗜睡、发作性睡病样症状及快速眼动期睡眠行为障碍等多种形式,与下丘脑、脑干、边缘系统等睡眠相关结构损害有关,下丘脑分泌素之外的递质系统可能参与发作性睡病症状的发生.
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散发性肌萎缩侧索硬化与运动神经元生存基因缺失的关系
目的 探讨我国散发性肌萎缩侧索硬化(SALS)与运动神经元生存基因(SMN)缺失之间的关系.方法 收集141例SALS患者和134名健康对照的外周静脉血并抽提DNA,应用聚合酶链反应.限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行SMN基因缺失筛查.缺失频率的比较采用卡方检验分析.结果 4例SALS患者和3名健康对照分别检出SMN2基因第7、8号外显子纯合缺失,缺失频率分别为2.84%(4/141)和2.24%(3/134),差异无统计学意义(χ2=0.0001,P=1.000).此外,所有研究对象均未检出SMN1基因纯合缺失.结论 SMN基因纯合缺失与我国SALS患者之间无明显相关性.
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同卵双生的界限型婴儿重症肌阵挛癫(癎)患者中的钠通道α1基因新突变
目的 筛查一对同卵双胞胎界限型婴儿重症肌阵挛癫(癎)(borderland severe myoclonic epilepsy of infancy,SMEB)患儿的钠通道α1(sodium channel α1-subunit,SCN1A)基因并探讨其临床特性.方法 总结这对同卵双生子患者的临床特点,应用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术筛查SCN1A基因全部26个外显子,对发现有异常洗脱峰者再进行直接测序.结果 这对孪生姐妹患者均具有典型SMEB的临床特点,她们在SCN1A基因第26号外显子被发现有相同的杂合突变(c.5348C>T),并导致编码的氨基酸改变(A1783E),为国际上首次发现该位点突变.结论 临床表型相似的SMEB同卵双胞胎存在相同位点的SCN1A基因突变,证实SMEB与婴儿重症肌阵挛癫(癎)同样是基因异常引起的疾病,而且基因与临床表型密切相关.
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慢病毒介导artemin基因修饰的骨髓间充质干细胞对帕金森病大鼠的治疗作用
目的 探讨慢病毒介导的artemin(ARTN)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)对帕金森病模型大鼠潜在性治疗作用及对脑内相关蛋白表达的影响.方法 分离培养大鼠MSCs,将携带ARTN的慢病毒载体转染MSCs;6-羟多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病大鼠模型,按随机数字表法随机分为假手术(Sham)组、帕金森病组、移植MSCs(MSCs)组、移植空病毒转染的MSCs(LV-MSCs)组、移植慢病毒介导的ARTN基因修饰的MSCs (LV-ARTN-MSCs)组,对帕金森病大鼠左侧纹状体进行细胞移植;术后2、4、6、8周,腹腔注射阿扑吗啡,进行行为学检测;采用Western印迹及免疫荧光法检测各组大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)表达变化,移植ARTN修饰的MSCs在大鼠脑组织内表达;高效液相色谱仪检测各组大鼠纹状体内多巴胺、二羟基苯乙酸、高香草酸含量.结果 LV-ARTN-MSCs组在阿扑吗啡诱发下30 min内旋转圈数(179.33±18.74)明显低于帕金森病组、MSCs组和LV-MSCs组(235.83±18.95、203.67±11.50和206.33±11.86;q=8.828,P＜0.01;q=3.802,P＜0.05;q=4.219,P＜0.05).LV-ARTN-MSCs组大鼠黑质TH阳性细胞百分比(64.05％±5.49％)显著高于帕金森病组(34.18％±3.35％)、MSCs组(52.59％±4.48％)和LV-MSCs组(50.57％±4.41％;q=13.280、5.135、6.028,均P＜0.01),黑质TH蛋白表达也明显提高,同时慢病毒介导ARTN修饰的MSCs可以在帕金森病大鼠脑内存活至少6周,主要集中在移植侧的纹状体区.细胞移植8周后,MSCs组(2.34±0.54)、LV-MSCs组(2.28±0.45)、LV-ARTN-MSCs组(6.54±0.51)与帕金森病组(0.87±0.07)大鼠相比,纹状体多巴胺表达明显提高(q =5.233,P＜0.05;q=5.020,P＜0.01;q=20.190,P＜0.01),以LV-ARTN-MSCs组明显.结论 纹状体移植慢病毒介导ARTN基因修饰的MSCs对帕金森病模型大鼠有一定的治疗作用.
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亨廷顿舞蹈病的IT15基因片段真核表达载体构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达定位
目的 构建亨廷顿舞蹈病的致病基因IT15基因片段的真核表达载体,观察其在SH-SY5Y细胞内的表达分布情况.方法 以PCR方法扩增出健康人和亨廷顿舞蹈病患者的IT15基因1号外显子片段,应用基因重组技术与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合构建以GFP为报告基因的重组真核表达质粒GFP-Htt-19Q与GFP-mHtt-70Q,并经酶切分析和测序证实.利用脂质体瞬时转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞;Western blot证实亨廷顿蛋白氨基末端片段在SH-SY5Y细胞内表达;荧光显微镜观察正常与变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在细胞内的表达定位情况.结果 健康人和亨廷顿舞蹈病患者的IT15基因1号外显子的PCR产物分别为170、310 bp的特异性片段;重组体GFP-Htt-199与GFP-mHtt-70Q经测序分析读码框正确,转染SH-SY5Y细胞后发现正常亨廷顿蛋白氨基末端片段弥散分布于胞质内,胞核内少见,而变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在核周及核内形成聚集物.结论 构建IT15基因片段真核表达载体是研究亨廷顿舞蹈病的发病机制的有效方法之一;变异亨廷顿蛋白氨基末端片段在核周及核内形成聚集物可能是亨廷顿舞蹈病致病的关键.
