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结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
目的 构建结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活作用.方法 用PCR技术特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,用PCR、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-ESAT-6.用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109b中,经表型筛选检测其自激活作用.结果 获得了无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-ESAT-6.结论 ESAT-6无自激活作用,可用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子.
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人肠三叶因子酵母双杂交载体的构建及其自激活作用鉴定
目的:构建人肠三叶因子(hITF/hTFF3)酵母双杂交诱饵载体并鉴定其自激活作用.方法:从人结肠黏膜提取总RNA.RT-PCR制备总cDNA,PCR扩增hTFF3基因,TA克隆至pGEMT载体并测序鉴定.经NcoⅠ/XhoⅠ双酶切,连接到pENTR11质粒构建入门克隆.LR反应获得酵母双杂交诱饵载体pDEST32-hTFF3,测序正确后与酵母双杂交空猎物载体pDEST22共同转化Mav203酵母细胞,SD/-Leu/-Trp固体培养基上生长.挑取单克隆划线接种到分别含有不同浓度氨基三唑(3AT)的SD/-Leu/-Trp/-His培养基上,观察重组诱饵载体的自激活情况.结果:从人正常结肠黏膜成功克隆了hTFF3基因,构建了pDEST32-hTFF3酵母表达质粒.转化pDEST32-hTFF3和pDEST22的Mav203酵母细胞可在3AT浓度为30 mmol/L以下的SD/-Leu/-Trp/-His培养基上生长,在3AT浓度为30mmol/L以上的培养基上则未见酵母细胞生长.结论:所构建的pDEST32-hTFF3可作为酵母双杂交的诱饵质粒.
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乙型肝炎病毒包膜大蛋白的自激活
目的:构建乙型肝炎病毒包膜大蛋白的酵母表达载体,研究其自激活作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV包膜大蛋白(LHBs),前-S1蛋白(pre-S1),前-S2蛋白(pre-S2)及主蛋白(SHBs)的编码基因,并在其5'端引入EcoRI/BamHI内切酶位点,分别连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后分别铺于含有X-α-半乳糖的营养缺陷型培养基SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade上进行自激活验证(蓝/白筛选).结果:成功克隆出编码各种HBV包膜蛋白的基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,转化了pGBKT7-LHBs和pGBKT7-preS1的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶从而在铺有X-α-半乳糖的培养基上呈现蓝色,而转化了pGBKT7-preS2和pGBKT7-SHBs的细胞只能在SD/-Trp的培养基上生长,且没有变蓝.结论:LHBs可以作为反式激活子发挥作用,代替GAL4蛋白的激活域来激活GAL4上游激活序列(GAL UAS)和TATA盒,从而激活了下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达,并且其自激活作用来自于前-S1结构域.
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人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用鉴定
目的 构建人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体并验证其自激活作用.方法 以pET32a-hITF质粒为模板,PCR扩增hITF成熟肽cDNA片段,Sal I和EcpRV双酶切后连接到pENTR3c载体,通过λ噬菌体臂同源重组反应(LR重组反应)将hITF片段连接到酵母双杂交诱饵载体pDEST32,获得诱饵质粒pDEST32-hITF,测序后与酵母双杂交空质粒pDEST22共转化到酵母菌株Mav203,经营养缺陷培养基筛选后,观察在含不同浓度3-氨基三唑(3AT)的营养缺陷培养基中pDEST32-HITF的自激活作用.结果 成功克隆hITF基因片段,构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-hITF,其与酵母双杂交空载体pDEST22共转化到酵母菌株Mav203后,可在3AT浓度为0、10、25mmol/L的营养缺陷培养基上生长,而在3AT浓度为50、75、100mmol/L的营养缺陷培养基上不能生长.结论 成功构建酵母双杂交诱饵载体,经验证50mmol/L及以上浓度的3AT营养缺陷培养基可以抑制其自激活作用.
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TNF-α转化酶酵母双杂交系统"诱饵"质粒的构建及鉴定
目的:构建酵母双杂交系统"诱饵"质粒栽体pGBKT7-TACE,并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从小鼠肝组织提取总RNA,用RT-PCR的方法获得TACE,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACE在MATHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3中的自激活和毒性作用.结果:本实验成功构建了"诱饵"质粒载体pGBKT7-TACE,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用.结论:构建的诱饵质粒pGBKT7-TACE可应用在酵母双杂交系统中,为筛选小鼠cDNA文库中与TACE相互作用的蛋白奠定实验基础.
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Tec 家族蛋白酪氨酸激酶Itk PH结构域的克隆鉴定及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测
Tec家族蛋白酪氨酸激酶Itk特异地表达于T细胞,对T细胞的成熟与活化等具有很大影响,因而可能在T细胞的信号转导过程中处于重要位置.我们利用PCR的方法从含Itk基因全长cDNA的pME18S-EMT质粒中扩增出其PH结构域基因片段,并将其克隆人酵母双杂交载体pLexA,经测序鉴定正确,转化酵母细胞EGY48(p8op-lacZ),挑取阳性克隆,利用液相法和平板法检测,证实PH结构域无自激活作用,且对宿主菌无毒性作用,可用于T细胞cDNA文库的筛选,捕捉与之相互作用的蛋白.
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肿瘤坏死因子α转化酶胞内区诱饵质粒的构建及鉴定
目的: 构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-TACEc(肿瘤坏死因子α转化酶胞内区),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法: 从BALB/c雄性小鼠睾丸组织提取总RNA,用RT-PCR方法获得TACEc,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACEc在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用.结果: 实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-TACEc,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用. 结论: pGBKT7-TACEc可应用在酵母双杂交系统中,寻找小鼠睾丸cDNA文库中与TACEc相互作用的蛋白质,为筛选小鼠睾丸中与TACEc相互作用的蛋白奠定了重要基础.
关键词： 肿瘤坏死因子α转化酶 睾丸 酵母双杂交系统 自激活作用 -
禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测
目的 构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用.方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Western blot验证诱饵蛋白的表达.结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达.结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白.
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小鼠巨细胞病毒即刻早期基因M122酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测
目的 构建小鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-M122,并检测其自激活作用及对酵母AHl09菌株有无毒性作用,用于筛选小鼠胚胎脑cDNA文库.方法 采用反转录(RT)-PCR的方法扩增MCMV的MI22基因片段,并将其插入到pMD18-T simple vector,构建重组质粒pMD18-T-M122.用限制性内切酶EcoR I和Sal I将莺组质粒酶切鉴定,并测序.测序正确的pMD18-T-M122重组质粒和载体pGBKT7-BD分别用限制性内切酶EcoR I和sal I进行双酶切,凝胶回收M122基因片段及pGBKT7-BD载体片段.将回收的M122基因片段和pGBKT7-BD载体片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建诱饵质粒pGBKT7-M122.对pGBKTF-M122进行酶切鉴定,测序.将测序正确的pGBKT7-M122转化AH109酵母感受态细胞,转化菌液涂布于营养缺陷培养基SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-α-Gal平板.空载体质粒pGBKT7-BD和阳性质粒pCL作为对照亦被转入AH109酵母感受态细胞,转化菌液分别涂布于SD/-Trp平板和SD/-Leu/X-α-Gal半板.观察平板上菌落的颜色、数量及大小.结果 1.成功构建了用于酵母双杂交筛选的诱饵载体pGBKT7-M122,其在SD/-Trp/X-α-Gal平板上的菌落为白色.2.转化有重组质粒pGSKT7-M122和空载体质粒pGBKT7的酵母菌株AH109,在2个SD/-Trp平板上长出的菌落大小一致数量相当.结论 构建的诱饵质粒pGBKT7-M122无自激活作用,对酵母菌株AH109亦无毒性.能够用于酵母双杂交系统以筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白分子.
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用于酵母双杂交的M-CSF诱饵载体的构建和鉴定
目的构建用于酵母双杂交系统的结合域(binding domain,BD)诱饵载体pGBKT7-M-CSF, 并检测其是否具有自身激活作用.方法用PCR方法从M-CSF cDNA中扩增出M-CSF的胞外活性区, 引入酶切位点SalⅠ、 NcoⅠ, 与pGBKT7载体连接起来, 并检测pGBKT7-M-CSF在酵母双杂交系统3中的自激活作用.结果成功构建了BD诱饵载体pGBKT7-M-CSF, 并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用.结论 pGBKT7-M-CSF可以用于酵母双杂交系统中, 找出与M-CSF相互作用的分子.
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HBV PreS1蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应
目的 利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵质粒,并检测其表达产物对cdc25酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBV PreS1基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-PreS1.经测序正确后其将转化酵母菌cdc25感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用.结果 序列测定证实重组诱饵质粒pSos-PreS1构建成功.重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用.结论 可以利用SRS来研究与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础.
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NDRG家族成员酵母双杂交诱饵载体的构建,表达及自激活检测
目的:构建NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用,为用酵母双杂交方法寻找与NDRG家族相互作用的分子奠定实验基础. 方法:用PCR方法获得NDRG家族4个成员cDNA全长,将4个片段按正确读框插入酵母表达质粒PGBKT7中,经限制性酶切鉴定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109,Western验证4个分子的正确表达,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用. 结果:构建了NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵载体,并在酵母中正确表达,除NDRG4-B外NDRG1,2,3均无自激活作用. 结论:NDRG1,2,3可以用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子. NDRG4-B由于有自激活作用不能用于酵母双杂交的筛选.
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HSP70诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测
目的: 构建用于酵母双杂交系统的"诱饵"载体pGBKT7-Hsp70,并检测其是否具有自激活作用. 方法: 用PCR的方法从质粒pBBS212-Hsp70中扩增出Hsp70基因片段,引入酶切位点EcoRⅠ, BamHⅠ. 测序正确后,将Hsp70基因克隆至载体pGBKT7中,并检测 pGBKT7-Hsp70在MATHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3中的自激活作用. 结果: 成功构建了"诱饵"载体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用. 结论: pGBKT7-Hsp70可以用于酵母双杂交系统中,寻找与Hsp70相互作用的分子.
