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大蒜新素对鼠巨细胞病毒感染小鼠脾细胞IL-12基因转录、表达和功能的影响
目的:阐明大蒜新素对鼠巨细胞病毒(MCMV)感染小鼠脾细胞TH1类细胞调控因子IL-12基因转录、表达和功能的影响和其在抗MCMV机制中的作用.方法:60只BALB/c小鼠随机分成大蒜新素治疗组(20只)、安慰剂组(20只)和正常对照组(20只).治疗组在造模后24 h开始腹腔注射大蒜新素一般剂量(25mg·kg-1),每天1次,共14 d;安慰剂组和正常对照组注射等量生理盐水.各组分别于治疗后第3,5,7,10,14天各处死4只小鼠,RT-PCR法检测各组小鼠脾细胞IL-12 p35,IL12 p40 mRNA表达强度;双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清中TH1细胞调控因子IL-12 p70蛋白和TH1类细胞因子IFN-γ的蛋白表达水平.结果:安慰剂组在感染后第3天IL-12 p70蛋白和IL-12 p35 mRNA表达显著增高,但第5天后急剧下降,显著低于正常小鼠;IFN-γ在感染后第3天达峰值,随后逐渐下降,在感染后第10～14天降至正常水平;而p40 mRNA则从感染第3天开始持续高水平表达.治疗组在治疗后第3天IL-12 p70蛋白,IL-12 p35,IL-12 p40 mRNA水平均显著增高达峰值(P＜0.05),但随后快速下降,在第5～14天稳定在正常细胞水平;IFN-γ亦在治疗后第3天表达至峰值,第5天稍有下降,但随后表达逐渐上调,在治疗后第7～14天显著高于安慰剂组和正常对照组(P＜0.01).结论:大蒜新素能完全纠正MGMV感染后第5～14天诱导的IL-12 p70蛋白和IL-12 p5 mRNA表达下调以及IL-12 p40 mRNA表达上调;同时还能持续上调IFN-γ表达,提示其还可能通过其他途径促进IFN-γ分泌.大蒜新素的上述作用有助于纠正MCMV诱导的TH1/TH2细胞网络失衡,增强特异性细胞免疫功能和抗病毒因子的分泌而有利于机体清除MCMV病毒,可能是其抗MCMV效应的另一作用机制.
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MCMV感染同种异型皮肤移植小鼠结肠炎模型的建立
利用小鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus,MCMV)感染同种异型皮肤移植小鼠,建立MCMV感染结肠炎症模型,从而为研究人类肠道疾病提供可靠的动物模型.采用鼻腔接种的方式感染同种异型皮肤移植的小鼠.①供体:C57BL/6雌鼠,18只;受体:BAL,B/c雌鼠,72只,鼠龄4～6周,体重14～20g/只;将C57BL/6小鼠的背部皮肤移植到BALB/c小鼠背部的移植床上,术后给BALB/c小鼠腹腔注射环孢素连续2周(12mg/kg.d).②将移植后小鼠随机分组.每组24只,按接种病毒接种剂量分为10<'4>PFU组和10<'5>PFU组,同时设立阴性对照组,即鼻腔接种细胞悬液(1×10<'6>/mL).每日观察动物排便情况及体重等总体情况变化;分别于病毒接种后第5、9、14和第21d取得小鼠结肠组织,通过组织病理学检测、原位杂交、gB RT-PCR、pp65免疫组化以及透射电镜的方法,观察检测小鼠结肠组织中MCMV与其组织病理变化之间的关联性.结果:在10<'5>PFU组中,小鼠出现厌食、嗜睡、活动能力明显下降,且发现该组小鼠的体重下降.在本研究中我们检验感染后第14d小鼠的结肠组织,发现感染组小鼠的近端结肠组织中粘膜层均变薄,同时其结构也被破坏;感染组小鼠的远端结肠组织中均出现淋巴样滤泡和粘膜层结构异常,其中10<'6>PFU组小鼠的结肠粘膜层的破坏得更严重;pp65免疫组化检验结果为MCMV蛋白阳性;原位杂交结果显示结肠组织中MCMV IE1基因阳性,MCMV gB基因RT PCR检测结果为阳性;透射电镜观察可见疱疹样病毒颗粒.而阴性对照组上述检测指标均为阴性.结果表明,在同种异型皮肤移植后小鼠鼻腔接种MC-MV,小鼠结肠发生了类似于人类结肠炎的病理变化.该结肠炎动物模型的建立将为进一步研究HCMV感染结肠的发病机理以及药物干预建立一个极为重要的平台.
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MCMV诱导鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞凋亡及其作用机制
目的:观察鼠T细胞淋巴瘤细胞株EL4细胞能否被小鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus,MCMV)感染及其感染前后对EL4细胞形态的变化及凋亡的影响.方法:分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、10、100的MCMV smith株感染EL4细胞,于感染后1、3和5d收集细胞;设立正常对照组、MOI=1感染组、MOI=10感染组、MOI=100感染组;另外设有更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组、MCMV+ GCV组.应用瑞氏-姬姆萨染色后光学显微镜下观察细胞形态,台盼蓝抗染法计数细胞存活率,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测感染细胞内MCMV DNA基因拷贝数,流式细胞技术检测细胞凋亡,RT-qPCR检测感染细胞P53、P21、cFlip、Caspase8的mRNA表达水平,Western blot检测Caspase8、P53、BAX、BCL-2、Cleaved-Caspase3的蛋白表达水平.结果:瑞氏-姬姆萨染色后光学显微镜下可见被MCMV感染的EL4细胞体积增大,细胞核不规则并见折叠扭曲.与正常对照组相比,随着感染复数的增加以及感染时间的延长,各感染组EL4细胞存活率降低,凋亡率增加(P＜0.05),并均可上调凋亡蛋白P53、BAX/BCL-2、Cleaved-caspase3和Caspase8表达;且细胞存活率下降、凋亡率升高及各凋亡蛋白上调均以MOI=10感染ELA细胞后d5为明显.与MCMV感染组(MOI =60)比较,MCMV+ GGV组(MOI=60,GCV 25μg/ml)EL4细胞内MCMV DNA含量降低(P＜0.05),EL4细胞凋亡率及凋亡蛋白P53、Caspase8、BAX/BCL-2表达降低(P＜0.05);与正常对照组比较,GCV组EL4细胞凋亡率及凋亡蛋白P53、Caspase8、BAX/BCL-2的表达无明显差异.结论:鼠T细胞淋巴瘤细胞株EL4细胞可被MCMV感染,呈现出明显凋亡现象.EL4细胞在MCMV感染后凋亡蛋白P53、BAX/BCL-2、Cleaved-caspase3、Caspase8表达上调.更昔洛韦抑制感染的EL4细胞内MCMV DNA复制并减弱MCMV对EL4细胞的杀伤作用.
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Th17细胞在小鼠巨细胞病毒感染急性期的作用研究
目的 整体水平观察Th17细胞在小鼠巨细胞病毒(MCMV)播散性感染急性期的作用.方法 建立MCMV播散性感染模型,病毒接种后第3、7、14和28天各处死3只小鼠;同时设模拟感染鼠作为对照.应用real-time PCR法检测MCMV感染鼠脏器MCMV DNA载量;HE染色观察MCMV感染后脾组织病理损伤变化;流式细胞术检测脾细胞中CD4+IL-17A+T细胞比率;ELISA法检测脾细胞培养上清中IL-17A蛋白浓度.结果 感染急性期唾液腺组织中MCMV DNA于感染后14 d高;脾组织病理损伤也于感染后14 d严重;与模拟感染对照鼠相比,MCMV感染鼠脾细胞中CD4+IL-17A+T细胞比率呈升高趋势(均P＜0.01),且于感染后14 d达峰值[(1.14±0.09)％ vs (0.19±0.04)％,t=17.551,P=0.000];病毒特异性IL-17A浓度也于感染后14 d达峰值[(81.98±12.37) pg/ml vs (44.96±8.44) pg/ml,t=4.281,P=0.006];脾细胞培养上清中病毒特异性IL-17A水平与唾液腺组织中MCMV DNA载量呈正相关(r=0.54,P＜0.05);脾组织病理损伤越重,脾细胞培养上清中IL-17A浓度越高.结论 Th17细胞主要通过IL-17A参与MCMV播散性感染急性期免疫应答,直接或间接的促进病毒复制或脾组织局部病理损伤,可能是MCMV持续性感染的重要原因之一.
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巨细胞病毒感染加重载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化
目的 本研究以载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein-E knockout,apoE-/-)小鼠为研究对象,给予低剂量的小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV),以期了解在模拟人体内潜伏感染状态下病毒对动脉粥样硬化形态学方面的影响,以及凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like ox-LDL receptor-1,LOX-1)基因的表达变化,以探讨MCMV在动脉粥样硬化形成及发展过程中所起的作用.方法 采用随机数字表法将32只高脂饮食apoE-/-小鼠随机分为2组,其中1组经腹腔感染MCMV,分别在感染后14周、18周和24周截取主动脉;另1组不感染MCMV.通过HE染色观察2组动物主动脉粥样硬化病变的面积、数目、分级和内膜/中膜比值,实时定量PCR(real-time PCR)检测动脉壁和唾液腺中的MCMV含量以及LOX-1基因表达量的变化.结果 研究显示在慢性潜伏感染阶段,MCMV感染明显加重apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变面积;但随感染时间的延长,该作用逐步减弱.小鼠动脉壁中没有MCMV mRNA的表达.血浆MCMV抗体含量、唾液腺MCMV DNA含量和动脉粥样硬化病变程度没有相关性.感染后14周,病毒组LOX-1 mRNA含量较对照组明显增高.结论 在慢性潜伏感染阶段,MCMV感染可以明显加重apoE-/-小鼠主动脉AS病变,并使重度AS病变提前出现,但在血管壁局部并无MCMV活动性感染的证据.MCMV感染后可增加动脉壁LOX-1基因表达,LOX-1的高表达可能是MCMV加重动脉粥样硬化形成的途径之一.
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小鼠巨细胞病毒PCR诊断方法的建立及其应用
目的 建立小鼠巨细胞病毒(MCMV) PCR检测方法,并进行初步应用.方法 根据NCBI公布的巨细胞病毒设计引物,进行PCR体系优化、敏感性、特异性测试;运用优化后的方法,对87份小鼠血清进行检测,对阳性样本进行测序分析.结果 建立的小鼠巨细胞病毒PCR方法灵敏度高,特异性好,初步检测4个屏障设施的87份小鼠血清,13份为阳性,通过测序证实为小鼠巨细胞病毒,验证了此方法的可行性.结论 为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法.
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小鼠巨细胞病毒对小鼠体外受精、卵裂和囊胚形成的影响
目的 探讨小鼠巨细胞病毒对小鼠成熟卵母细胞体外受精、卵裂和囊胚形成的影响.方法 在IVF-30培养液中加入100TCID50、10TCID50、1 TCID50小鼠巨细胞病毒,观察小鼠成熟卵母细胞体外受精、卵裂和囊胚形成情况.结果 与正常对照组比较,各病毒组的卵母细胞体外受精率、卵裂率以及囊胚形成率差异均无显著性意义.结论 小鼠巨细胞病毒对小鼠卵母细胞体外受精、卵裂和囊胚形成无明显影响.
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小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型的建立
目的:我们建立了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型,来实现小鼠脑内潜伏的巨细胞病毒(MCMV)的激活,并对潜伏MCMV激活时程进行分析,确定MCMV即刻早期蛋白基因1(ie1)基因转录,完成对ieJ基因转录和活病毒产生量时程动力学的分析,以及为进一步阐明原始MCMV在脑中潜伏的细胞类型提供模型.方法:采用出生后两天的BALB/c幼鼠,经右侧耳和眼连线为底边的正三角形的中心将Smith Strain MCMV 500 PFU/5 μ.L注射进入右侧脑室,培养至16周.之后,将脂多糖(LPS)依15 μg/kg体重(接近致死量)分别经腹腔和侧脑室内注射,对照组注射生理盐水.于注射后的1日,2日,5日,7日,14日和21日分别在LPS组和对照组中选取5只小鼠取脑.应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和高敏感性病毒空斑实验(结合病毒空斑实验和RT-PCR)测定MCMV即刻早期蛋白Ⅰ(IE1)mRNA的表达以及活病毒产生定量分析.结果:LPS组中,可于14日和21日的脑内检测到IE1 mRNA的转录,敏感性病毒空斑实验只在14日和21日出现细胞病毒效应(CPE),病毒量约为4.29× 104 PFU/μL和5.20×105 PFU/μL,相应对应MEF细胞匀浆物的RT-PCR结果检测到7,14,21日有IE1 mRNA转录.结论:该实验成功建立了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活的模型,并证实和分析了即刻早期蛋白基因ie1在潜伏MCMV激活过程中的表达和时程.该模型的建立将为进一步阐明MCMV在脑中潜伏细胞类型以及MCMV在急性感染、潜伏和重激活过程中对中枢神经细胞的影响提供研究平台,并为人巨细胞病毒(HCMV)的临床研究提供实验依据.
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巨细胞病毒脑内感染小鼠听觉诱发电位的变化
目的 探讨脑内感染小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)后脑干听觉诱发电位(auditory brainstem response,ABR)的变化,以明确经脑内感染MCMV后小鼠ABR是否出现异常改变,从而验证经脑内感染MCMV能否建立巨细胞病毒(CMV)感染致听力损伤的动物模型,并在此基础上观察更昔洛韦对CMV感染致听力损伤的干预效果.方法 将24只新生小鼠按窝随机分成正常对照组、模型组、干预组3组,对照组经脑内注射无菌生理盐水10 μl,模型组与干预组经脑内接种TCID50为1×105 U/ml的MCMV病毒悬液10 μl,同时干预组在接种MCMV后第2天开始腹腔注射更昔洛韦60 mg/(kg·d),连用2周.2周后在小鼠麻醉状态下应用脑干听觉诱发电位仪在电屏蔽装置中检测小鼠的ABR,并记录ABR的波形以及Ⅰ波的潜伏期、波幅.结果 模型组与正常对照组相比潜伏期延长、波幅降低(F=9.151,P=0.011;F=5.095,P=0.043),更昔洛韦干预组与模型组相比潜伏期缩短、波幅升高(F=13.797,P=0.003;F=14.587,P=0.002),差异有统计学意义.结论 经脑内感染MCMV可以引起小鼠ABR的异常改变,脑内感染MCMV可建立CMV感染致听力损伤的动物模型,婴幼儿CMV感染后早期应用更昔洛韦对CMV感染致听力损伤的进行性发展有一定的抑制作用.
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颅内感染鼠巨细胞病毒对新生小鼠血-迷路屏障通透性的影响
目的 探讨新生小鼠鼠巨细胞病毒(MCMV)性耳聋发病过程中血迷路屏障通透性的改变及其可能机制.方法 66只新生BALB/C小鼠随机均分为三组:A组颅内注射MCMV 15 μl;B组颅内注射生理盐水15 μl;C组作为空白对照.3周后声电屏蔽下行听觉脑干反应(ABR)检查后取两侧耳蜗,伊文思蓝甲酰胺法检测血迷路屏障通透性,光镜下观察内耳病理变化.结果 与B、C组相比,A组小鼠ABRⅠ波潜伏期延长,波幅降低,听力阈值和耳蜗伊文思蓝含量升高(P＜0.05).光镜下A组小鼠耳蜗前庭阶、鼓阶有出血现象,血管纹及螺旋韧带内有较多炎症细胞浸润;B、C组小鼠耳蜗无上述变化.结论 新生小鼠颅内感染MCMV后,血迷路屏障通透性增高是发生MCMV性耳聋的一个重要环节.
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小鼠巨细胞病毒感染内耳的病理变化
目的 研究小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染内耳的病理变化,并观察更昔洛韦(GCV)对MCMV感染所致内耳炎症反应的疗效.方法 72只小鼠随机均分为生理盐水(NS)10μl组(A组)、MCMV 10μl组(B组)、MCMV 10 IA+GCV 60 mg·kg-1·d-1(C组),每组均根据脑内、腹腔、耳内(仅左耳接种)注射部位不同进一步分组,每小组各8只.2周后耳蜗取材.结果 B组脑内、耳内感染方式下左耳耳蜗前庭膜增厚伴淋巴细胞浸润、蜗管顶部分泌表皮层纤维化改变;而B组腹腔、耳内感染方式下右耳及C组脑内、耳内感染方式下左耳耳蜗均未见上述病理变化.结论 脑内感染MCMV较腹腔、耳内(左耳)感染更易引起双耳前庭膜和蜗管的炎症反应.应用GCV干预对MCMV感染所引起的内耳炎症反应有一定的治疗作用.
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MCMV感染对小鼠海马胶质纤维酸性蛋白表达的影响
目的 探讨小鼠巨细胞病毒感染对小鼠学习记忆及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法采用颅内注射制造CMV颅内感染小鼠模型,利用Morris水迷宫试验对2组动物的学习和记忆成绩进行3 d测试,记录其成绩并观察海马组织GFAP表达水平的变化.结果 Morris水迷宫测试的结果显示,病毒感染组小鼠的学习记忆成绩明显下降,海马组织中GFAP的表达较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.01).结论巨细胞病毒感染能够导致小鼠学习记忆能力下降,海马组织GFAP的表达明显增强.
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IL-1β和TNF-α在小鼠巨细胞病毒性心肌炎组织中的表达及其意义
目的研究IL-1β和TNF-α在巨细胞病毒(MCMV)心肌炎小鼠心肌组织中的表达及在心肌损伤中的作用.方法将60只4周龄BALB/C小鼠随机分为两组,实验组(36只)腹腔注射10-4TCID MCMV,对照组(24只)注射3T3细胞裂解液.观察腹腔注射后3、7、14d心肌组织中IL-1β TNF-α的表达及心肌病理改变.结果实验组心肌组织出现灶性或弥散性炎性细胞浸润、心肌细胞变性和坏死,对照组无病理改变.实验组IL-1β、TNF-α蛋白主要表达在炎性浸润细胞、变性或坏死的心肌细胞,而对照组几乎无表达.结论 IL-1β、TNF-α在MCMV心肌炎心肌组织中表达,并可能在其发病中起重要作用.
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小鼠巨细胞病毒即刻早期基因M122酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测
目的 构建小鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-M122,并检测其自激活作用及对酵母AHl09菌株有无毒性作用,用于筛选小鼠胚胎脑cDNA文库.方法 采用反转录(RT)-PCR的方法扩增MCMV的MI22基因片段,并将其插入到pMD18-T simple vector,构建重组质粒pMD18-T-M122.用限制性内切酶EcoR I和Sal I将莺组质粒酶切鉴定,并测序.测序正确的pMD18-T-M122重组质粒和载体pGBKT7-BD分别用限制性内切酶EcoR I和sal I进行双酶切,凝胶回收M122基因片段及pGBKT7-BD载体片段.将回收的M122基因片段和pGBKT7-BD载体片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建诱饵质粒pGBKT7-M122.对pGBKTF-M122进行酶切鉴定,测序.将测序正确的pGBKT7-M122转化AH109酵母感受态细胞,转化菌液涂布于营养缺陷培养基SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-α-Gal平板.空载体质粒pGBKT7-BD和阳性质粒pCL作为对照亦被转入AH109酵母感受态细胞,转化菌液分别涂布于SD/-Trp平板和SD/-Leu/X-α-Gal半板.观察平板上菌落的颜色、数量及大小.结果 1.成功构建了用于酵母双杂交筛选的诱饵载体pGBKT7-M122,其在SD/-Trp/X-α-Gal平板上的菌落为白色.2.转化有重组质粒pGSKT7-M122和空载体质粒pGBKT7的酵母菌株AH109,在2个SD/-Trp平板上长出的菌落大小一致数量相当.结论 构建的诱饵质粒pGBKT7-M122无自激活作用,对酵母菌株AH109亦无毒性.能够用于酵母双杂交系统以筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白分子.
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小鼠巨细胞病毒播散性感染急性期脾脏损伤的免疫病理机制
目的:观察小鼠巨细胞病毒(MCMV)播散性感染急性期脾组织病理损伤程度与病毒量、caspase-1和下游促炎因子IL-1β、IL-18表达的关系,探讨MCMV感染后脾脏的免疫病理损伤机制.方法:建立MCMV全身播散性感染模型,MCMVSminth株接种后第3、7、14和第28天各处死3只小鼠；同时设模拟感染小鼠作为对照.标准空斑试验检测脾组织病毒滴度；Western blot法检测脾脏中caspase-1表达强度；免疫组化法检测脾组织中IL-1β和IL-18表达状况,HE染色后用半定量法评估脾脏组织病理损伤程度；分析病毒滴度及caspase-1、IL-1 β和IL-18表达与组织病理损伤的关系.结果:MCMV感染后,脾组织病毒滴度在感染后3d升高,7d明显下降,14 d时用标准空斑试验已检测不到病毒；与模拟感染对照组比较,MCMV感染组感染后第3天脾组织中caspase-1表达明显升高后逐渐下降(P＜0.01)；脾组织中IL-1β和IL-18表达呈进行性升高,于感染后7d达峰值,14d减少,28d基本接近正常；脾组织病理损伤呈进行性加重,至感染后14 d达高峰,28d明显减轻；IL-1β和IL-18在脾组织中的高表达早于其组织病理损伤,随着IL-1β和IL-18表达水平的下降,病理损害也逐渐恢复.结论:巨细胞病毒感染引起caspase-1表达增加,促进炎性因子(IL-1β、IL-18)合成和释放增加.IL-1 β、IL-18不仅有抗病毒作用,同时也可能参与MC-MV播散性感染后脾组织的免疫病理损伤.
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用原位杂交技术研究小鼠巨细胞病毒对巨噬细胞的感染
目的检测巨细胞病毒(CMV)是否能够感染并影响小鼠腹腔巨噬细胞.方法以小鼠巨细胞病毒(MCMV)攻击小鼠腹腔巨噬细胞后,用地高辛标记的152bp MCMV DNA探针进行原位杂交测定.结合受染细胞形态学改变,巨细胞包涵体检测,以及细胞表面Fc受体表达(Fc花环形成)的变化,观察MCMV对单核-巨噬细胞的作用.结果原位杂交技术检测表明受MCMV攻击的巨噬细胞的胞浆和核内,有杂交阳性的灰蓝色颗粒沉积,与阳性对照细胞片(小鼠成纤维细胞3T3)相一致;未受MCMV攻击的巨噬细胞片(阴性对照)中,则未见有着色颗粒.同时发现,受染细胞的形态改变,核呈现典型的嗜酸性包涵体;受染细胞表面Fc受体表达呈上调趋势.结论巨细胞病毒能够感染巨噬细胞并影响其形态和功能.
