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氧化苦参碱抑制异丙肾上腺素诱导大鼠慢性心力衰竭及对ADMA代谢通路的影响
目的:探讨氧化苦参碱抑制异丙肾上腺素(ISO)诱导大鼠慢性心力衰竭及其对非对称二甲基精氨酸(ADMA)代谢通路的影响.方法:雄性Sprague-Dawley大鼠,皮下注射IS0 5 mg·kg-1·d-1,连续给药7d诱发大鼠慢性心力衰竭.氧化苦参碱(100,50 mg· kg-1)于ISO注射前7d灌胃给药,共14 d.检测血清学指标、心功能血流动力学参数、心脏质量,并观察心肌组织病理变化,同时采用Western blotting法测定相关蛋白的表达.结果:氧化苦参碱(100,50 mg· kg-1)可显著降低ISO诱导的心力衰竭大鼠升高的血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTn Ⅰ)水平,改善左心室收缩和舒张功能及左心室重构,显著减轻ISO致大鼠心肌的病理学改变.还可降低ISO诱导心力衰竭大鼠血清ADMA含量(P＜0.01),增加心室肌组织中二甲基二甲胺水解酶2(DDAH2)蛋白的表达(P＜0.01),但对ISO诱导升高的蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)无影响.结论:氧化苦参碱可改善ISO诱导的慢性心力衰竭大鼠的心功能,抑制心室重构,其作用机制与降低血清ADMA水平和增高心肌组织DDAH2表达水平有关.
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利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系
目的 利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果.方法 利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果.结果 与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止.同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响.结论 成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具.
关键词： CRISPR-Cas9 PRMT1 小鼠胚胎干细胞 -
PRMT1精氨酸甲基化作用的研究进展
PRMT1属于Ⅰ型PRMT酶，分子大小约40 kDa，常以大分子复合体形式发挥作用。其底物分子众多，酶活性受多因素调节。PRMT1参与了细胞信号转导、DNA损伤修复、转录调节、RNA代谢、蛋白质相互作用等多种细胞过程。PRMT1与多种癌性疾病及非癌性疾病有关。
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人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建人PRMTl基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA；经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞；用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆；经菌液PCR及测序鉴定重组质粒；瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响.通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达.结果:RT-PCR扩增的人PRMTl全长cDNA为1136 bp；所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致；实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达；并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性.结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础.
