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CRISPR-Cas9技术的发展与临床应用前景
CRISPR-Cas系统作为细菌、真菌体内的适应性免疫系统用以抵御外来噬菌体的感染.经过改造的CRISPR-Cas9已成为继ZFN、TALEN之后的第三代基因编辑技术.在CRISPR-Cas9基础上衍生的CRISPRi、CRISPRa等系统可以实现暂时抑制、激活或改变基因表观遗传学修饰的功能.相比传统基因编辑技术,CRISPR-Cas9具有效率高、操作简便、价格低等优势,因而在基因制备动物模型,治疗感染性疾病、遗传性疾病以及癌症等方面均有广阔的应用前景.本文主要对CRISPR-Cas9技术的发展与临床应用进展进行综述.
关键词： CRISPR-Cas9 基因编辑 临床应用前景 -
双酶切法构建CRISPR-Cas9载体系统的研究
目的 以pet41a质粒为载体骨架,通过酶切连接法构建crispr-cas9载体系统,建立一种简单有效的基因编辑载体,为研究细菌耐药基因的敲除提供方法. 方法 选择质粒pet41a、pwt-cas9和pgRNA,分析核酸序列,选择合适酶切位点.使用XhoⅠ和BgiⅡ两种限制性内切酶分别酶切pet41a和pwt-cas9,形成带有相同粘性末端的线性载体片段,回收并用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-cas9.使用BgiⅡ和XbaⅠ两种限制性内切酶分别酶切pet41-cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-cas9-gRNA.分别将重组质粒pet41-cas9和pet41 a-cas9-gRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析. 结果 测序证实质粒pet41-cas9、pet4 1a-cas9-gRNA连接正确,载体构建成功.重组质粒粒转染DE3后经IPTG诱导4h,表达相对分子质量为160×103的重组蛋白,与cas9蛋白理论分子质量相符. 结论 成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41a-cas9-gRNA并表达重组cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了实验基础.
关键词： 基因编辑技术 CRISPR-Cas9 载体构建 限制性内切酶 -
小鼠MYSM1基因稳定敲除的间充质干细胞系C3H10T 1/2的建立及其体外免疫调节作用
目的:本研究旨在构建小鼠组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1基因敲除的间充质干细胞系(mesenchymal stem cells,MSC),并初步探讨MYSM1基因敲除后MSC免疫学特性的变化.方法:通过CRISPR-Cas9技术对小鼠间充质干细胞系(C3H10T 1/2) MYSM1基因进行特异性基因敲除,再采用流式细胞术、定量PCR和蛋白印迹(Western blot)技术检测基因敲除情况.为检测MYSM1敲除对MSC免疫调节能力的影响,将MYSM1基因敲除的MSC上清加入脾脏淋巴细胞培养体系中,在镜下观察其对淋巴细胞增殖的调节作用,并进一步采用定量PCR检测淋巴细胞内炎性因子白介素4,干扰素γ、白介素17A和Foxp3的表达情况.结果:流式细胞术、定量PCR及Westernblot的鉴定结果表明,CRISPR-Cas9技术稳定敲除了MSC细胞系内MYSM1基因.敲除了MYSM1基因之后的MSC上清显著抑制刀豆蛋白A诱导的淋巴细胞增殖及炎性因子分泌(P＜0.05).结论:本研究成功地构建了小鼠MYSM1稳定敲除的间充质干细胞系,同时发现MYSM1敲除后MSC体外免疫抑制作用增强,此相关发现为深入研究MYSM1基因的功能,探索基因修饰MSC对免疫相关性疾病的治疗奠定了基础.
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Bcl-2基因敲除对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨Bcl-2基因对人胰腺癌SW1990细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计并合成靶向Bcl-2基因的sgRNA(Bcl-2-sgRNA),通过CRISPR-Cas9系统将其结合到CRISPR载体Cas9,经测序验证后转染人胰腺癌细胞株SW1990,筛选Bcl-2基因敲除稳转细胞,以野生型SW1990细胞作为对照.采用CCK-8法测定细胞生长曲线,通过克隆形成实验计数细胞克隆数,运用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 成功获得Bcl-2基因敲除的人胰腺癌SW1990细胞株,其Bcl-2蛋白表达缺失.与野生SW1990细胞比较,敲除Bcl-2基因的SW1990细胞的生长被抑制,细胞克隆形成数量显著减少[(160.7±10.0)个比(285.3±14.2)个],G1期细胞比例显著增加[(84.51±0.97)％比(57.49±1.08)％],S期细胞比例显著减少[(12.82±0.99)％比(27.56±1.65)％],细胞凋亡率显著增加[(12.67±0.59)％比(0.37±0.35)％],差异均有统计学意义(P值均＜0.01).结论 敲除Bcl-2基因可抑制胰腺癌SW1990细胞的生长,降低细胞克隆形成能力,使细胞阻滞在G1期,并显著增加细胞凋亡率.
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AIF基因的能量代谢功能分析
目的：量化AIF基因在细胞能量代谢中的功能特性，探讨该基因相关听神经病的分子致病机制。方法选择第三代基因编辑工具CRISPR-Cas9技术结合阳离子脂质体转染技术，快速实现对HELA细胞的AIF基因进行敲除，并通过Western blot进行蛋白表达分析，Sanger测序进行基因型的分析，然后利用Oxygraph-2K对多个AIF基因敲除细胞系以及野生型细胞系进行氧化供能的检测，后采用GraphPad prism5.00进行数据分析。结果通过该方法获得了多株AIF基因敲除细胞系，并发现野生型细胞系耗氧功能明显强于AIF基因敲除细胞系。结论通过CRISPR-Cas9技术的应用，本研究快速实现了AIF蛋白表达缺失细胞系和野生型细胞系在氧化呼吸方面的差异比较，间接量化了该基因缺失所导致的能量损失，能量供应障碍可能是听神经病的致病机制之一。
关键词： AIF基因 听神经病 CRISPR-Cas9 基因敲除 氧化耗能 -
利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系
目的 利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果.方法 利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果.结果 与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止.同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响.结论 成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具.
关键词： CRISPR-Cas9 PRMT1 小鼠胚胎干细胞 -
利用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠黑色素瘤细胞系MATP基因的初步研究
目的 利用CRISPR/Cas9系统,敲除小鼠黑色素瘤细胞系的MATP基因,为MATP基因的功能研究奠定基础.方法 利用http://crispr.mit.edu/网站,设计针对MATP的特异性引物,并将引物链接到pCAS9/gRNA1载体.将阳性载体转染小鼠黑色素瘤细胞系B16F10,利用无限稀释的方法获得转染后的单克隆细胞株.提取不同细胞株的基因组,通过测序的方法进一步筛选出发生MATP基因切割的细胞株,并利用Western-blot的方法验证MATP的表达情况.结果 成功获得了3株MATP基因敲除的细胞株,Western-blot结果表明,该细胞株不表达MATP蛋白.结论 利用pCAS9/gRNA1载体,可以实现B16F10细胞系MATP基因的敲除.
关键词： CRISPR-Cas9 黑色素瘤细胞 MATP 研究 -
利用CRISPR-Cas9系统鉴定丙型肝炎病毒感染必需的胞内宿主因子
目的 鉴定丙型肝炎病毒(HCV)感染过程必需的胞内宿主因子,为发现新的抗病毒靶点提供科学依据.方法 利用涵盖19 050个人类基因的CRISPR-Cas9文库小向导RNA(sgRNA)慢病毒感染人肝癌细胞Huh7.5(共计1×108个细胞),然后利用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性标记筛选出成功敲除基因的细胞克隆群,再将细胞克隆群感染HCVJFH1株(感染复数为0.30),通过与未敲除的Huh7.5细胞(对照组)感染水平比较,筛选获得较对照组感染水平明显降低的细胞克隆群.后通过Illumina测序获得该克隆被敲除的基因序列,利用短发夹RNA(shRNA)技术对单个基因分别验证,明确HCV感染必需的胞内宿主因子.结果 利用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性标记成功筛选出经CRISPR-Cas9文库敲除基因的细胞克隆,利用免疫荧光检测获得了与对照组相比HCV感染水平明显下降的细胞克隆,将这些克隆进行Illumina测序,结果提示至少存在10个可能与HCV感染水平降低相关的基因.shRNA敲低单个基因验证结果显示,与未敲除的Huh7.5细胞相比,单独敲低MTCP1和RPS14基因的Huh7.5细胞的HCV感染率均降低,差异均具有统计学意义(均P＜0.05),表明MTCP1和RPS14是HCV感染必需的两个胞内宿主因子.结论 建立了利用CRISPR-Cas9系统鉴定HCV感染必需的胞内宿主因子的新方法,筛选出了MTCP1和RPS14这两个HCV感染必需的胞内宿主因子,为深入研究其作用机制奠定了基础,也为发现新的抗病毒靶点提供了科学依据.
关键词： CRISPR-Cas9 丙型肝炎病毒 宿主因子 敲除 -
应用CRISPR-Cas9基因编辑技术实现染色体大片段缺失
目的 应用CRISPR-Cas9基因编辑技术来实现同一染色体片段上的多个基因共缺失.方法 利用分子克隆技术构建能使小鼠染色体11B3上Aloxe3-Alox 12b-Alox8基因簇缺失的CRISPR-Cas9慢病毒质粒;通过转染HEK293T细胞来包装带CRISPR或Cas9 cDNA的慢病毒,进而感染小鼠NIH3T3细胞,提取这些细胞的全基因组;通过PCR扩增缺失后的片段,TA克隆、Sanger测序等技术手段鉴定Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇缺失的情况.结果 成功构建了能使Aloxe3-Aloxl2b-Alox8基因簇发生缺失的CRISPR-Cas9慢病毒质粒;PCR检测证实了目的染色体片段(Aloxe3-Alox 12b-Alox8基因簇)的缺失;TA克隆和Sanger测序明确了Aloxe3-Aloxl2b-Alox8基因簇发生缺失,并且该CRISPR-Cas9系统介导的切割事件产生的断点被准确地连接在一起,在两个切割位点间没有发生插入突变.结论 利用CRISPR-Cas9基因编辑技术可以有效实现小鼠染色体11B3上Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇的大片段缺失.
关键词： CRISPR-Cas9 基因编辑 染色体大片段缺失 血液系统肿瘤 -
CRISPR-Cas9系统编辑DNA诱导基因敲除的发展及优缺点
CRISPR是一种特别的免疫系统,它可以对入侵到细菌或古生菌体内的病毒和核酸进行特异性识别,利用Cas9蛋白酶进行切割,达到自身免疫的效果,它是绝大部分细菌和一些古生菌的天然免疫系统.本文通过对近期CRISPR的研究文献的阅读,总结了CRISPR-Cas9系统的工作原理,对不同目标的基因敲除的实验原理和实验过程进行了分析,比较了CRISPR基因编辑技术与传统的基因编辑技术的不同,初步讨论如何提高CRISPR的敲除效率;结合以上实验的研究,总结了CRISPR的优缺点,通过对近期发现的大规模脱靶效应现象进行讨论,进一步讨论了关于CRISPR技术未来的发展.
关键词： CRISPR-Cas9 靶向敲除 基因编辑 Guide-RNA 脱靶 -
利用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7细胞中进行基因敲除
目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型.方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变.然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞.后利用实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测.结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变.荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50％左右(P＜0.05).此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75％左右(P＜0.05).结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型.
关键词： CRISPR-Cas9 GT1-7 miR-29a 单克隆细胞 -
阻断PD-1/PD-L1通路的免疫疗法在恶性肿瘤治疗中的研究进展
近年来,程序性死亡受体1(programmed death receptor 1,PD-1)/程序性死亡配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)信号通路作为介导肿瘤免疫逃逸的重要途径而备受关注,抑制甚至阻断PD-1/PD-L1通路以增强T细胞毒性作用、提高机体免疫应答成为当下研究热点并取得了一系列突破性成果.目前,以PD-1/PD-L1抑制剂和CRISPR-Cas9技术靶向敲除PD-1/PD-L1基因为代表的免疫治疗策略已开始从实验室走向临床.与此同时,新的免疫治疗靶点的发现和治疗策略的组合将有助于更好地实现对PD-1/PD-L1信号通路的抑制作用,从而更有效地发挥此种免疫疗法在肿瘤治疗中的辅助作用.但目前阻断PD-1/PD-L1通路的免疫疗法仍存在适用人群有限、治疗效果相对欠佳等缺陷.此外,传统的肿瘤治疗评价标准对免疫疗法并不完全适用,新的标准亟待完善并规范化以用于临床疗效评价.本文将从PD-1/PD-L1信号通路出发,简明阐述其机制,并对当前研究成果进行全面介绍,同时聚焦国内外新研究进展并对这一领域的发展趋势作出展望.
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CRISPR-Cas9敲除Notch1对CNE2细胞增殖及辐射敏感性的影响
背景与目的:Notch信号转导通路对鼻咽癌的发生、发展及维持肿瘤干细胞的自我更新等具有重要作用,既往研究方法难以使Notch通路中特定基因功能完全丧失.本研究旨在利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Notch1基因敲除的CNE2鼻咽癌细胞系,并观察Notch1敲除对CNE2细胞增殖、辐射敏感性的影响.方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测人鼻咽癌细胞CNE2及鼻咽正常上皮细胞NP69中Notch1表达水平;利用sgRNA在线设计工具,针对Notch1设计sgRNA;利用PX459质粒构建含sgRNA的敲除载体PX459-Notch1-sgRNA;将质粒瞬时转染CNE2细胞,经过药物筛选、克隆化培养、Western blot检测、免疫荧光染色验证得到Notch1敲除的CNE2鼻咽癌细胞系;采用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测方法、克隆形成实验检测Notch1敲除组(Notch-KO)与未转染亲本组(Parental)、转染PX459空载体水平较的对照组(Ctrl)的增殖活性及辐射敏感性,并进一步采用流式细胞术检测侧群细胞比例.结果:与NP69细胞相比,CNE2细胞中Notch1蛋白水平较高;Western blot检测、免疫荧光染色验证Notch1基因被完全敲除.Notch1基因敲除可抑制细胞增殖活性(P<0.05);Notch1-KO组的D0、Dq和SF2值分别为1.160、1.881和0.630 Gy,低于Parental(1.176、2.533和0.824 Gy,P<0.001)和Ctrl组(1.182、2.516和0.819 Gy,P<0.001);Notch1-KO中侧群细胞比例[(1.13±0.01)％]较Parental[(3.81±0.03)％]、Ctrl[(3.70±0.03)％]明显下降(P<0.001).结论:运用CRISPR-Cas9技术可成功敲除CNE2细胞中的Notch1基因,Notch1基因敲除导致CNE2细胞增殖能力下降、辐射敏感性增加、侧群细胞比例降低.
关键词： Notch1基因 CRISPR-Cas9 鼻咽癌 辐射敏感性 -
CRISPR-Cas9技术在非肿瘤性血液病中的应用
近来随着CRISPR-Cas9精确基因组编辑系统的出现,血液学疾病研究的方法学取得了革命性的进展.CRISPR-Cas9技术被证实可用于去除和纠正基因或突变,并在人类细胞中引入位点特异性治疗基因.因此,该系统介导的基因治疗已经成为遗传性血液疾病治疗的理想方法,并且有望在不久的将来通过纠正致病突变来缓解疾病相关症状.在人类使用CRISPR-Cas9介导的基因校正之前,必须确定具有高效率和特异性的适当的递送系统,同时须建立应用具有可控安全性的技术和道德准则.该文对CRISPR-Cas9技术在非肿瘤性血液学疾病中的应用现状、当前挑战和未来方向进行了综述和讨论.
关键词： CRISPR-Cas9 基因编辑 非肿瘤性血液病 应用 -
UCHL1基因缺失突变A549肿瘤细胞单克隆株的建立与特性分析
本研究旨在探索泛素羧基末端水解酶L1 (ubiquitin C-terminal hydrolase-L1,UCHLl)对非小细胞肺癌细胞系A549细胞的作用.用CRISPR-CAS9基因编辑技术构建UCHL1基因敲除的A549细胞株,用RT-PCR和Western blot检测A549细胞中UCHL1基因敲除情况,用CCK-8检测细胞增殖能力的变化,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,用CCK-8检测A549细胞对顺铂药物敏感性的改变,用划痕与Transwell实验检测A549细胞迁移能力的变化,用Western blot检测与A549细胞迁移有关的蛋白表达变化.结果显示,使用CRISPR-CAS9技术构建的基因移码突变导致A549细胞株UCHL1 mRNA和蛋白缺失,UCHL1基因功能缺失后A549细胞增殖和各细胞周期比例没有明显变化,但对顺铂的药物敏感性降低,迁移能力下降,Erk 1/2蛋白磷酸化水平升高.以上结果提示,UCHL1基因功能缺失可导致A549细胞顺铂耐药性提高,细胞迁移能力降低,其机制可能涉及Erk1/2信号通路的激活.
关键词： UCHL1 CRISPR-Cas9 非小细胞肺癌 耐药性 迁移 -
CRISPR-Cas9基因编辑技术在眼科疾病中的应用
规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及相关核酸内切酶9(CRISPR associated protein,Cas9)技术是一种由RNA指导核酸内切酶的基因编辑技术.该技术以其操作简便、基因敲除效率高、靶向精准、周期短等特点迅速被用于多个物种的基因组编辑及疾病基因治疗中.本文旨在对CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型和治疗眼科疾病中的应用进展进行综述.
关键词： CRISPR-Cas9 基因组编辑 基因治疗 眼科疾病 -
通过CRISPR-Cas9系统敲减PAEC中GGTA1和CMAH基因的效果检测
目的:检测由短回文重复序列(CRISPR)-Cas9系统敲减猪动脉内皮细胞(PAEC)中基因α1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)和CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)的效果.方法:通过CRISPR-Cas9系统,用已设计好的GGTA1和CMAH基因的guide RNA (gRNA)构建质粒,以慢病毒为载体包装病毒和感染PAEC,对成功感染的细胞进行单克隆培养并挑选收集单克隆细胞,提取细胞基因组,进行PCR,琼脂糖凝胶电泳,退火、酶切,测序等方法对GGTA1和CMAH基因敲减的效果进行检测.结果:对单克隆细胞进行选择性测序,选择V2-g-a1、V2-c-b1、V2-c-d4单克隆细胞测序结果分别为:V2-g-a1细胞基因组突变位点在第205位V2-c-b1细胞基因组突变位点在第240位;V2-c-d4细胞基因组突变位点在第246位.结论:CRISPR-Cas9系统成功构建质粒,完成慢病毒包装和感染细胞,成功敲减目的基因.
关键词： GGTA1 CMAH CRISPR-Cas9 PAEC 单克隆细胞 -
CRISPR敲减猪CMAH基因的质粒构建及慢病毒的包装
目的:构建靶向猪CMAH基因的慢病毒CRISPR-Cas9敲减质粒及进行慢病毒的包装.方法:设计并合成CMAH基因gRNA的靶序列并将其与LentiCRISPR-v2载体连接;连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组子后酶切鉴定与测序;制备VSV-G、Rev、Gag/Pol等质粒用于包装慢病毒.结果:成功构建猪CMAH基因CRISPR-Cas9敲减质粒并包装出相应慢病毒.结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够构建敲减猪CMAH基因的质粒并能够使用其包装出病毒,为后续感染猪动脉内皮细胞(porcine aorta endothelial cell,PAEC)细胞敲减CMAH基因及功能验证奠定基础.
关键词： 慢病毒包装 基因敲减 CMAH基因 CRISPR-Cas9 -
CRISPR-Cas9敲减猪GGTA1基因的质粒构建
目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒.方法:将LentiCRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪GGTA1基因的gRNA(guideRNA,gRNA)序列,对LentiCRISPR-v2质粒进行BsmBI酶切及电泳和胶回收,并将胶回收产物与gRNA序列进行连接,构建LentiCRISPR v2-gRNA重组质粒,将该重组子转化感受态DH5α,培养过夜后,将其涂布于含有氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固体培养基,筛选阳性单克隆DH5α进行培养并提取质粒,对提取的LentiCRISPR-v2-gRNA敲减质粒进行KpnI与EcoRI双酶切验证与序列测定.结果:LentiCRISPR-v2载体酶切结果正确;目的gRNA序列成功插入酶切后的LentiCRISPR-v2载体且序列正确.结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒,该研究为后续慢病毒的包装及CRISPR-Cas9系统敲减猪GGTA1基因的效率与功能研究奠定了基础.
关键词： 基因敲减 CRISPR-Cas9 GGTA1基因 -
CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建动物疾病模型中的应用
CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种新的基因编辑技术,可以在靶基因位点直接进行基因组编辑。它由一条导向 RNA(short single guide RNA,sgRNA)指导 Cas9核酸酶识别和切割双链 DNA,诱发非同源末端连接或同源重组,从而实现在目的 DNA 上进行随机的突变、特定 DNA 片段插入或内源性突变修复等基因编辑。该技术已成功被用于包括人类体细胞在内的多种细胞、植物及动物上进行基因编辑。本文主要对利用 CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物疾病模型的应用进行综述。
关键词： CRISPR-Cas9 基因编辑 非同源末端连接 同源重组 动物模型
