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CMAH基因在小鼠不同组织中的转录水平分析
目的 哺乳动物细胞中所含唾液酸及其衍生物主要包括N-乙酰神经氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac) 、N-羟乙酰神经氨酸 (N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc) 和脱 氨神经氨酸 (deaminoneuraminic acid,KDN),其中Neu5Ac可在胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶 (cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH)的催化下合成Neu5Gc.本 研究应用相对荧光定量PCR方法检测BALB/c小鼠不同组织中CMAH基因的转录水平,为进一步分析不同组织中所含Neu5Gc含量差异提供参考依据.方法 在NCBI数据库中查找CMAH基因mRNA序列并设计特异引 物,选择小鼠β-actin为内参基因,应用相对荧光定量PCR方法检测正常BALB/c小鼠9种组织中CMAH基因mRNA的转录情况.结果 在9种不同的小鼠组织中,肝脏组织中CMAH基因mRNA转录水平高,其分别 为脾脏的2. 46 倍、肾脏的3. 17 倍、气管的5. 14 倍、肺脏的11. 70 倍、心肌的21. 12 倍、骨骼肌的31. 37倍、小肠的66. 90倍以及脑组织的1055. 99倍.结论 本研究确定BALB/c小鼠CMAH基因在多 种组织中均有转录且差异较大.
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通过CRISPR-Cas9系统敲减PAEC中GGTA1和CMAH基因的效果检测
目的:检测由短回文重复序列(CRISPR)-Cas9系统敲减猪动脉内皮细胞(PAEC)中基因α1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)和CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)的效果.方法:通过CRISPR-Cas9系统,用已设计好的GGTA1和CMAH基因的guide RNA (gRNA)构建质粒,以慢病毒为载体包装病毒和感染PAEC,对成功感染的细胞进行单克隆培养并挑选收集单克隆细胞,提取细胞基因组,进行PCR,琼脂糖凝胶电泳,退火、酶切,测序等方法对GGTA1和CMAH基因敲减的效果进行检测.结果:对单克隆细胞进行选择性测序,选择V2-g-a1、V2-c-b1、V2-c-d4单克隆细胞测序结果分别为:V2-g-a1细胞基因组突变位点在第205位V2-c-b1细胞基因组突变位点在第240位;V2-c-d4细胞基因组突变位点在第246位.结论:CRISPR-Cas9系统成功构建质粒,完成慢病毒包装和感染细胞,成功敲减目的基因.
关键词： GGTA1 CMAH CRISPR-Cas9 PAEC 单克隆细胞
