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Tec 家族蛋白酪氨酸激酶Itk PH结构域的克隆鉴定及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测
Tec家族蛋白酪氨酸激酶Itk特异地表达于T细胞,对T细胞的成熟与活化等具有很大影响,因而可能在T细胞的信号转导过程中处于重要位置.我们利用PCR的方法从含Itk基因全长cDNA的pME18S-EMT质粒中扩增出其PH结构域基因片段,并将其克隆人酵母双杂交载体pLexA,经测序鉴定正确,转化酵母细胞EGY48(p8op-lacZ),挑取阳性克隆,利用液相法和平板法检测,证实PH结构域无自激活作用,且对宿主菌无毒性作用,可用于T细胞cDNA文库的筛选,捕捉与之相互作用的蛋白.
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PKB的PH结构域在原核表达及其纯化和活性
目的利用原核系统表达原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶B(PKB)的PH结构域,为进一步研究其结构和功能奠定基础.方法我们构建了PKB的PH结构域的表达质粒,在大肠杆菌中表达出PH结构域,并利用蛋白N端加入的组氨酸标签进行亲和层析及离子交换层析纯化蛋白.结果在大肠杆菌中表达的PH结构域以包涵体形式存在,经变性和复性后成为具有天然构象的可溶性蛋白,经亲和层析和离子交换层析纯化的PH结构域具有与磷脂酰肌醇PI*.4,5*.P2的结合能力,证明其具有生物学活性.结论本方法成功表达纯化了PKB的PH结构域,可用作PH结构域结构和功能的进一步研究.
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PH结构域中的框架结构
目的 研究17个PH结构域中的框架结构.方法 利用蛋白质分析软件Clustalx1.83对17个PH结构域的一级结构进行了序列比较,同时也对Loop1,Loop2,Loop3以及β4-β5,β5-β6之间的序列进行比较.根据N-J方法对这17个PH结构域中β1、β2、β3和α螺旋进行聚类分析.结果 β1,β2,β3,β4,β5,β6,β7,α螺旋中存在框架结构,分别是K/R-GY/W L-K/RQ,WK/R-RW/YF-L-,I/L-Y/W Y/F,GVL/I,X--V/I/T,V/TF-XX,Y/F-F,EE--WI/L--X.结论 在这17个PH结构域中存在由保守氨基酸残基构成的框架结构.
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从人T细胞淋巴瘤cDNA文库中筛选含PH结构域编码序列的新基因
目的从T细胞中获得更多含PH结构域编码序列的新基因.方法采用低严谨核酸杂交技术,根据T细胞中已知的PH结构域的分子设计探针,对人T细胞淋巴瘤cDNA文库进行筛选.结果在筛选过程中得到了4个新基因,各cDNA长度依次为:1 733 bp、2 308 bp、2 130 bp和1 647bp,分别编码含229、376、211和143个氨基酸残基的多肽.经生物信息学分析,在基因数据库中未发现与此4种cDNA序列类似的基因.该4个基因均已被GenBank收录,登录号分别为:AF334588、AF334589、AF334590和AF334792.结论这些新基因的获得及进一步研究,可能会为深入探讨T细胞激活机制提供新的线索.
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PH结构域与细胞信号转导
PH结构域是一段存在于血小板中的主要的PKC底物Pleckstrin中的重复序列.同源序列分析证实这一约100个氨基酸组成的相对保守的序列亦存在于多种其它的信号转导分子例如:蛋白激酶类,GTP酶类,GTP结合蛋白调节分子,磷酯酶C以及某些细胞骨架蛋白中.这样的分布特点表明PH结构域可能与SH2或SH3结构域的功能类似,即介导信号转导分子间的相互作用,构成细胞信息传递的网络.蛋白酪氨酸激酶Tec家族成员Btk的N端含有PH结构域,其点突变可导致遗传性免疫缺陷病(XLA)的现象提示该结构域在B细胞的发育中可能具有重要功能.
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重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性
目的 鉴定表达guanine-nucleotide-releasing factor (GRF)的pleckstrin homology （PH）结构域与谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的可溶性，并进一步检测该重组蛋白与蛋白激酶C（PKC）的结合及对PKC活性的影响. 方法 将表达GRF的PH结构域与GST融合蛋白的菌体经超声裂解，上清中的融合蛋白用琼脂糖珠锚定纯化. Western blot检测融合蛋白与PKC的结合，以PKC活性检测试剂盒测定结合后PKC的活性变化. 结果 获得信号分子GRF的PH结构域-GST融合蛋白的可溶性表达. Western blot结果表明,GRF的PH结构域可在体外与PKC结合.PKC活性实验显示,GRF的PH结构域抑制PKC活性. 结论 GRF的PH结构域可在体外与PKC结合并对PKC的活性具有下调作用.
