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PNPLA3基因表达以及干扰腺病毒的构建及鉴定
目的 构建糖脂代谢和脂肪肝相关基因PNPLA3过表达以及干扰腺病毒载体并加以鉴定.方法 根据PNPLA3基因序列设计过表达以及干扰序列引物,定向克隆人穿梭载体pAdTraek-CMV的Bgl Ⅱ和Xho I位点,干扰序列克隆人pAdTrack-U6穿梭载体,Pme I酶切线性化穿梭质粒与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共转化E.coli BJ5183感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I酶切线性化的回收质粒转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293A细胞绿色荧光蛋白的表达,并初步观察其感染小鼠原代细胞的效率.结果 测序、酶切鉴定证实,构建出了PNPL43基因过表达及干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.5×10<'11>VP/mL.以120感染复数感染小鼠肝脏原代细胞,感染效率可达到90%以上,干扰效率超过80%以上.结论 成功构建了PNPLA3基因的过表达以及干扰腺病毒载体.
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PNPLA3 rs738409基因多态性在肝病中的作用
肝脏脂肪蓄积是非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)、酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的普遍现象,并与炎症发展、疾病进程有关,在丙型肝炎病毒(hepatitis V virus,HCV)感染患者中也多见报道,并影响抗HCV治疗效果.虽然引起三者脂肪蓄积的因素不尽相同,但是不同肝病的肝细胞脂肪蓄积的遗传因素越来越引起人们关注.PNPLA3作为patatin样磷脂酶家族成员,考虑其可能有三酰甘油水解酶活性从而影响肝脏脂肪代谢.近年来PNPLA3 rs738409基因多态性成为NAFLD、ALD、HCV的研究热点并取得诸多重要成果.本文就PNPLA3在人体内的表达及其rs738409基因多态性在上述疾病中的研究现况作一综述.
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PNPLA3rs738409G/C基因多态性与肝癌易感性关系的Meta分析
目的 探讨PNPLA3基因多态性与肝癌易感性关系.方法 计算机检索数据库,收集有关PNPLA3基因多态性与肝癌病易感性关系病例对照研究,提取纳人文献的相关数据进行Meta分析,以病例组与对照组PNPLA3各种基因模型的比值比(OR)为效应指标,Egger's检验和Bgger's检验偏倚.结果 共8篇研究符合纳入标准,累计病例数1266例,对照组3529例.Meta分析表明PNPLA3基因多态性与肝癌病易感性有明显关联性.结论 PNPLA3基因多态性与肝癌病易感性明显关联性[GG vs CC:OR=3.05,95％CI:2.42～3.86;CG vs CC:OR =1.30,95％CI:1.13 ～1.50;CG/GG vs CC:OR =1.39,95％CI:1.23～1.57;GG vs CG/CC:OR=2.90,95％CI:2.32～3.63].
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PNPLA3基因多态性与原发性肝癌遗传易感性的相关性研究
目的：评估PNPLA3 I148M基因多态性与原发性肝细胞癌（HCC）相关性，并探讨其机制。方法：本研究纳入HCC患者67例和健康对照组69例，对照组无肝癌家族史及肝病病史。通过聚合酶链反应（PCR）及基因测序法检测PNPLA3 rs738409基因表型，通过Hardy-weinbeurg遗传平衡定律分析HCC组与对照组各基因型是否具有群体代表。通过字2检验分析HCC组rs738409各基因型的频率分布有无差异。结果：对HCC组及对照组经吻合度检验，各组基因多态性分布均符合Hardy-Weinberg（H-W）平衡法则（P>0.05）。HCC组与对照组148 GG、148 CG、148 CC基因型频率分布差异均有统计学意义（字2=6.30，P<0.05）。结论：rs738409基因表型与原发性肝癌发病风险具有相关性。
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PNPLA3对棕榈酸引起的肝细胞凋亡的影响
目的 研究含patatin样磷脂酶域3(PNPLA3)对棕榈酸(PA)引起的肝细胞凋亡的影响及相关机制.方法 以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,分为过表达空载体(NC)组,过表达野生型PNPLA3(PNPLA3WT)组以及过表达突变型PNPLA3(PNPLA3 I148M)组,PA处理24h,油红染色检测细胞内脂质沉积,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,蛋白印迹法检测内质网应激及相关凋亡蛋白水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清溶血卵磷脂(LPC)水平.结果 PA处理24h后,3组细胞脂肪沉积差异无统计学意义(P＞0.05).与NC组相比,PNPLA3WT和PNPLA3I148M组细胞凋亡率分别增加了2倍和3倍.内质网应激相关的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)通路激活,免疫球蛋白结合蛋白(BIP)、p-PERK、p-eIF2α蛋白表达增加,内质网应激凋亡通路CCAAT增强子结合蛋白(CHOP)、线粒体凋亡通路相关蛋白p53上调凋亡因子(PUMA)、Bax、caspase-3表达增加,且PNPLA3I148M组增加更明显.PNPLA3WT和PNPLA3I148M组在PA干预前后细胞上清LPC水平分约别为NC组的5倍和1.5倍.结论 PNPLA3可能通过调节LPC的代谢继而激活内质网应激相关凋亡途径参与PA诱导的肝细胞凋亡.
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PNPLA3基因rs738409多态性与代谢综合症在中国人群中的研究
目的:研究中国人群中PNPLA3基因rs738409位点多态性与代谢综合征之间的相关性.方法:收集了381例二型糖尿病患者和380例正常人的血液样本,使用全血提取试剂盒从781份样本中提取全基因组DNA,并利用飞行质谱技术进行目标位点的SNP分型,将分型结果与各临床指标进行统计学分析.结果:①经SNP分型结果与二型糖尿病病例-对照的关联性分析,rs738409位点多态性与二型糖尿病无显著相关性(P=0.74).②经SNP分型结果与其他临床指标的统计分析,rs738409位点多态性与高密度脂蛋白水平(P=0.029),甘油三酯水平(P=0.021),总胆固醇水平(P=0.038)及谷丙转氨酶水平(P=0.004)显著相关.结论:rs738409位点多态性与二型糖尿病的发病无显著相关性,但它通过氨基酸替换影响了与其关系紧密的基因表达,进而影响机体内各因素代谢水平的改变.
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中国汉族人群PNPLA3I148M多态性影响脂联素水平及非酒精性脂肪性肝病遗传易感性的相关性研究
目的:探讨在中国人群中PNPLA3 I148M基因型、脂联素与非酒精性脂肪性肝病的遗传易感性的相关性,及PNPLA3基因型与空腹血清脂联素水平的关系.方法:对96例NAFLD患者和76名正常对照,采用多聚酶链反应(PCR)及直接测序法检测PNPLA3基因型.计量资料结果均用均数±标准差((X)±s)表示,经方差齐性检验后,行t检验；性别、基因型及等位基因频率的比较行X2检验.结果:中国汉族人群中,存在PNPLA3基因I148M多态性,I148MG等位基因频率分布在NAFLD( 64.89％)与正常对照组(34.87％)、NASH组(71.70％)与SS组(56.09％)中比较差异均有统计学意义(P＜0.05).病例对照分析显示:148GG基因携带者与148CC基因携带者相比较,前者发生NAFLD的比值比(OR)为3.45(95％CI:2.21～5.41,P＜0.05),发生NASH的OR为1.98(95％CI=1.08～3.64,P＜0.05).PNPLA3基因rs738409多态性与血清ALT水平有关(P＜0.05),对NASH组分层分析,148GG基因型BMI、ALT、FINS均高于148CC基因型(P＜0.05),血清HDL水平低于148CC基因型和148GC基因型(P＜0.05),这些结果提示等位基因G与肝脏炎症和肝脏脂肪增加有相关性.Ordinal Logistic回归分析显示PNPLA3 I148M多态性与低浓度血清脂联素水平相关(＜ 6μg/ml) (OR=2.78,95％CI=1.765～4.384,P＜0.05).结论:中国汉族人群中,PNPLA3基因I148M多态性与NAFLD的遗传易感性及脂联素的分泌调节相关,是决定NAFLD个体遗传易感性的重要因素.
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PNPLA3在实验性非酒精性脂肪性肝病中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究
目的:探讨PNPLA3在非酒精性脂肪性肝病中的表达水平及其CpG岛甲基化状态,探讨PNPLA3在NAFLD发生、发展中的作用.方法:1.采用10 μg/mL的油酸作用于人正常肝细胞株L02建立脂肪肝细胞模型,72h后经油红O染色,观察正常组、脂肪肝模型组及给药组细胞内脂滴形成情况,并用荧光定量PCR检测PNPLA3在三组肝细胞中的表达情况.2.采用专用DNA提取试剂盒分别提取正常组、脂肪肝模型组、给药组细胞中DNA,经亚硫酸转化后行PCR扩增目的基因,并用焦磷酸测序方法检测不同组PNPLA3 CpG岛中甲基化水平,探讨其在非酒精性脂肪肝中的作用.结果:1、脂肪肝模型组肝细胞PNPLA3 mRNA的表达高于正常组,经姜黄素给药后,其表达降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).2、在PNPLA3启动子区6个检测位点中,脂肪肝组位点2甲基化水平高于正常组,姜黄素给药后甲基化水平降低,差异均有统计学意义(P＜0.05),在其余各检测位点中甲基化水平无差异.结论:1、油红O染色后,脂肪肝模型组细胞内发现有大量红色脂滴积聚,而正常组基本上未见脂滴,姜黄素给药组脂滴较模型组减少,表明用10 μg/mL的油酸诱导能成功建立体外肝细胞模型.2、PNPLA3 mRNA在肝细胞中高表达及其启动子区甲基化状态异常参与非酒精性脂肪肝发病.3、抑制肝脏PNPLA3活性或降低肝细胞PNPLA3 mRNA的表达水平可能是今后治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一个新的治疗方法.
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PNPLA3基因与非酒精性脂肪性肝病发生发展相关性研究
目的：分析中国成人非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者PNPLA3基因多态性与肝脏损害的相关性，探讨遗传因素在中国成人NAFLD发生和发展中的作用。方法连续收集106例NAFLD患者和100名年龄、性别相匹配的健康人。用测序分型法和Taqman探针分型法分别测定所有纳入者rs738409、rs2281135的单核苷酸多态性（SNP）。同时测定患者肝功能（ALT、AST、GGT）、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，以及血压、身高、体质量、体质量指数（BMI）；用稳态模型评估法计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。结果 rs738409突变纯合型GG型NAFLD组（40.6%）高于健康对照组（13.0%），CC型则NAFLD组（17.9%）低于健康对照组（44.0%），差异有统计学意义（P<0.05)，携带等位基因G的NAFLD患者CG/GG组较CC组具有更高谷丙转氨酶（ALT）[（82.03±61.25）U/L比（53.84±38.78）U/L，P<0.05]、谷氨酰转肽酶（GGT）[（83.66±52.92）U/L比（56.42±34.02） U/L，P<0.01]；rs2281135突变纯合型AA型NAFLD组（24.5%）高于健康对照组（15.0%），野生GG型则NAFLD组（26.4%）低于健康对照组（44.0%），差异有统计学意义（P<0.05），携带突变基因A的患者较GG纯合子具有更高ALT[（85.52±61.63）U/L比（53.18±32.62）U/L、GGT[（84.08±54.21）U/L比（64.00±37.85）U/L，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 PNPLA3 rs738409和rs2281135多态性与NAFLD遗传易感性有显著相关性；PNPLA3 rs738409等位基因G和rs2281135等位基因A可增加肝损害（ALT、GGT）的风险，且与胰岛素抵抗无相关性。
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影响酒精性肝病发病的遗传学研究进展
酒精性肝病是由长期酗酒引起的肝功能损伤,对全球公众健康和社会发展造成严重威胁.但是,酒精性肝病的发病具有很大的个体差异.与酒精代谢酶、脂质储存、炎症反应和纤维化相关的基因多态性都可以影响酒精性肝病的发病风险.此外,近年来的全基因组关联研究,发现了PNPLA3 rs738409等在大部分人群中得到广泛验证的与酒精性肝病易感性相关的位点.这些研究,对于进一步了解疾病的发病机理及临床诊断和防治具有重要意义.本文将对近几年与基因多态性及酒精性肝病易感性相关的遗传学研究做一综述.
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PNPLA3 I148M基因多态性对乙型肝炎肝硬化的影响
目的 评估PNPLA3 I148M基因多态性与乙型肝炎肝硬化相关性.方法 本研究纳入乙肝肝硬化患者154例和健康对照组150例,对照组无乙型肝炎家族史及肝病病史.通过病例对照的研究方法来分析PNPLA3 I148M基因表型对乙型肝炎肝硬化的影响.结果 乙肝肝硬化组与对照组PNPLA3 I148M基因表型频率分布差异有统计学意义(P<0.05).经logistic回归分析发现PNPLA3 I148M基因型与谷丙转氨酶(P=0.050)、胆固醇(P=0.032)、胆碱酯酶(P=0.048)、HBsAg滴度(P=0.002)、E值(P=0.010)有相关性.结论 PNPLA3 I148M基因表型与乙型肝炎肝硬化的发病风险具有相关性(P<0.05),且体内谷丙转氨酶、胆固醇、胆碱酯酶、HBsAg滴度、E值与PNPLA3 I148M基因型有显著的相关性.
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PNPLA3基因慢病毒载体及其过表达Huh-7细胞系的构建
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)正在成为我国一个新的公共健康问题[1].PNPLA3 (patatin-like phospholipase domain-containing protein 3)基因I148M多态性与NAFLD密切相关,且此多态性参与了NAFLD的疾病进展[2-3].但是,其在NAFLD发病中的具体生物机制目前尚不明确.本实验利用基因重组技术,成功构建了携带PNPLA3基因野生型和I148M突变型的慢病毒载体,并感染人肝癌细胞株Huh-7细胞,建立了稳定过表达目的基因的细胞系,为深入研究PNPLA3基因的生物学功能提供了理想的细胞模型.
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青岛地区汉族人群PNPLA3基因rs738409(C→G)多态性与慢性乙型肝炎的相关性
目的 探讨PNPLA3基因rs738409 (C→G)多态性与青岛地区汉族人群慢性乙型肝炎的相关性.方法 收集185例慢性乙型肝炎(CHB)患者和164名正常人的血液标本,采用多聚酶链反应及DNA测序法分析PNPLA3基因型.计数资料比较进行x2检验,计量资料进行t检验,非条件logistic回归模型计算比值比(OR)及其95％可信区间(CI).结果 CHB组rs738409 G等位基因占31.9％,正常对照组为21.9％,两组等位基因频率差异有统计学意义(P＜0.05);G等位基因携带者患CHB的风险是C等位基因的1.67倍(OR=1.67,95％CI为1.18 ～ 2.34,P=0.003).经混杂因素校正后,logistic回归模型分析结果显示,与CC纯合子携带者相比,携带危险等位基因G的GG+ AG基因型增加CHB的发生风险,OR=1.76,95％ CI为1.14 ～ 2.71.结论 在青岛地区汉族人群中,PNPLA3基因rs738409 G等位基因者患CHB的风险性增加.
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PNPLA3基因I148M过表达的Huh7细胞中固醇调节元件结合蛋白-1c与甘油三酯的关系
目的 探讨PNPLA3基因I148M过表达的Huh7细胞中固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c与甘油三酯的关系. 方法 用空病毒和携带PNPLA3基因I148M突变型的慢病毒感染Huh-7细胞,构建空病毒组(对照组)和PNPLA3基因I148M突变型组(突变组).分别用油红O染色显示细胞内甘油三酯含量变化,用全自动生物化学分析仪测定各组细胞中甘油三酯及总胆固醇含量,荧光定量PCR测定SREBP-1c mRNA的水平变化.Western blot检测SREBP-1c蛋白的表达情况.两组均数的比较采用t检验,指标间的关系判定用直线相关分析. 结果 油红O染色显示突变组中甘油三酯含量增加.突变组的甘油三酯和总胆固醇含量明显升高,分别为(0.54±0.03)mmol/L和(0.28±0.03) mmol/L,高于对照组的(0.23±0.02) mmol/L和(0.13±0.02) mmol/L(t值分别为22.58和11.83,P值均＜0.01).SREBP-1c mRNA表达量增加,与对照组相比的差异具有统计学意义(P＜ 0.01).SREBP-1c蛋白也较对照组有所增加.突变组SREBP-1c水平与甘油三酯水平呈正相关(r=0.912,P＜0.01).结论 PNPLA3基因I148M多态性可促进脂肪合成增加,其中甘油三酯的合成增加可能通过SREBP-1c起作用,这为探讨非酒精性脂肪性肝病的发病机制提供了新线索.
关键词： 脂肪肝 甘油三酯类 固醇调节元件结合蛋白-1c PNPLA3 -
PNPLA3基因 I148M多态性对肝癌细胞株Huh-7细胞周期的影响
目的 探讨PNPLA3基因I148M多态性对人肝癌细胞株Huh-7细胞周期的影响及其相关机制. 方法 利用构建成功的稳定表达PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突变型的Huh-7细胞株,以空载体细胞为对照,流式细胞术检测转染的Huh-7细胞周期,Western blot方法检测细胞周期调节因子Cyclin D1、p53的蛋白表达情况.荧光定量PCR检测Cyclin D1、p53的mRNA表达情况.两组间比较用独立样本t检验. 结果 三组间各细胞周期细胞所占比例的两两比较显示野生型组细胞周期G1期(58.53％±0.35％),G2/M期(24.87％±0.60％),S期(16.60％±0.26％)参数与对照组对应各期(G1期59.27％±0.15％;G2/M期24.23％±0.31％;S期16.50％±0.26％)之间差异无统计学意义(P＞ 0.05);突变型组与野生型组相比,G1期细胞比例减少(突变型G1期38.37％±0.21％,P＜0.05),S期与G2/M期细胞比例相应增加(突变型S期27.47％±0.35％,G2/M期34.17％±0.15％,P＜0.05).与对照组相比,突变型组的p53 mRNA相对表达量明显上调(对照组1.06±0.41,突变型组6.54±0.34;P＜0.05);野生型组p53 mRNA相对表达量差异无统计学意义(1.66±0.30,P＞0.05).Cyclin D1 mRNA各组中的相对表达量差异均无统计学意义(对照组1.00±0.10,野生型组1.06±0.03,突变型1.11±0.04;P＞0.05).结论 PNPLA3基因I148M多态性通过上调p53的表达引起Huh-7细胞周期紊乱.
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PNPLA3基因多态性与非酒精性脂肪性肝病关系的初步探讨
目的 分析PNPLA3基因多态性与非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的关系,探讨PNPLA3 rs738409G突变基因携带者NAFLD发生的危险因素,为预防NAFLD的发生提供理论依据.方法 收集航天中心医院2012年～2013年体检者共617例,包括324例健康者和293例NAFLD患者.采用实时荧光定量PCR法检测所有研究对象的rs738409分型,并采用Oneway ANOVA比较不同基因型组之间年龄,性别,BMI,TG,CHOL,hs-CRP,ALT,AST,FPG,HbA1c,CEA,AFP和CA19-9差异有无统计学意义.采用单因素方差分析比较健康组和NAFLD组之间部分生化检测指标和肿瘤标志物的表达水平差异有无统计学意义.Logistic回归分析用于评估rs738409G携带者NAFLD发生的危险因素.结果 ALT (U/L)在CC,CG和GG基因型中的血清水平分别是17.8(12.9,25.3),20.00(14.40,27.65)和20.2(14.85,38.8),表达水平逐渐增高,差异均具有统计学意义(P值均＜0.05).AST(U/L)在CC,CG和GG基因型中的血清水平分别是20.3(17.6,24.5),20.70(17.95,25.20)和22.3(18.60,29.65),仅在CC组和GG组(P=0.000)、CG和GG组(P=0.004)之间的差异具有统计学意义(P值均＜0.05).年龄,性别,BMI,TG,CHOL,hs-CRP,FPG,HbA1c,CEA,AFP和CA19-9在不同基因型的表达差异无统计学意义(P值均＞0.05).BMI(Kg/m2),ALT (U/L),AST(U/L),TG(mmol/L),hs-CRP(mg/ml),FPG(mmo1/L)和HbA1c(％)在NAFLD患者组与健康对照组中的表达水平分别是[22.97±2.58 vs 26.74±2.35],[15.65(11.97,21.3) vs 24(17.55,35.4)],[19.8(17.3,23.5) vs 22(18.9,,27.35)],[0.99(0.75,1.40) vs 1.77(1.23,2.54)],[0.89(0.64,1.41) vs 1.43(0.96,2.51)],[4.88(4.61,5.21) vs 5.14(4.82,5.62)]和[5.50(5.3,5.7) vs 5.70(5.45,6.00)],差异均具有统计学意义(P值均＜0.05).Logistic回归分析结论显示,BMI,TG,ALT和HbA1c是rs738409G突变基因携带者NAFLD的危险因素,回归系数分别是0.707,2.968,2.765和21.301.结论 对于rs738409G突变基因健康携带者应该定期监测BMI,TG,ALT和HbA1c,预防NAFLD的发生.
关键词： PNPLA3 多态性 非酒精性脂肪性肝病 Logistic回归
