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hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响
目的观察人POT1(protection of telomeres 1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响.方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡.结果 pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48 h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期S期,而对凋亡无明显影响.结论 hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系.
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siRNA介导hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞Caspase-3的影响
目的应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异地抑制端粒保护蛋白POT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞Caspase-3活化的影响.方法利用作者课题组先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsDNA)的3种重组siRNA表达质粒(pmU6-shRNA1、pmU6-shRNA2和pmU6-shRNA3),由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT-PCR和EMSA法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过RT-PCR、Western blot和Caspase-3检测试剂盒分析Caspase-3表达和活化.结果 3种pmU6-shRNA重组质粒转染HeLa细胞48 h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平均降低,Caspase-3 mRNA表达水平基本无变化,Caspase-3 酶原水平降低,而Caspase-3 酶活性增高.结论 siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达的抑制导致细胞Caspase-3活化.
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人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达
目的:克隆人端粒保护蛋白 (human protection of telomeres 1,pot1)基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达.方法:RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测hpot1基因的表达水平.结果:来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高.结论:真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达.
