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NSPc1是维持HeLa细胞正常增殖的必要因子
目的 研究多梳蛋白家族成员NSPc1对HeLa细胞增殖的影响.方法 运用生物信息学设计并合成敲低NSPc1表达的siRNA序列,用半定量RT-PCR、Real-time PCR及Western blot等检测siRNA序列在HeLa细胞中敲低NSPc1的有效性;将相应有效序列构建到pSUPER载体中,观察其瞬时转染对HeLa细胞BrdU掺入的影响;用G418筛选并建立稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,观察敲低NSPc1对HeLa细胞体外增殖能力的影响.结果 (1)设计的siRNA序列可显著敲低NSPc1的表达;(2)瞬时敲低NSPc1阻碍了HeLa细胞BrdU的掺入;(3)成功构建稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,其增殖速度较对照组明显变慢.结论 NSPcl的正常表达是维持HeLa细胞正常增殖能力所必需的,稳定敲低NSPcl的HeLa细胞群可作为进一步研究NSPc1相关信号通路的有效模型.
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维甲酸诱导的神经管缺陷小鼠模型中神经系统相关基因的表达
目的 研究在全反式维甲酸诱导小鼠神经管畸形模型中神经系统相关基因(ASH2L、HDAC4、NSPC1与DOK5)的表达变化.方法 取8只E8.5的C57/BL6孕鼠随机均分为对照组和模型组.给对照组腹腔注射橄榄油,给模型组腹腔注射全反式维甲酸；E13.5取胚胎.用real-time PCR检测两组小鼠脑和脊髓中ASH2L、HDAC4、NSPC1与DOK5的mRNA表达；用Western blot检测蛋白表达.结果 全反式维甲酸可诱导小鼠出现典型神经管畸形；与对照组相比,致畸胚胎脑和脊髓中,ASH2L、HDAC4、NSPC1和DOK5的mRNA和蛋白水平显著下降(P＜0.05).结论 ASH2L、HDAC4、NSPC1和DOK5可能是抑制全反式维甲酸致神经管畸形的潜在基因.
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人NSPc1慢病毒过表达系统的建立与鉴定
目的 建立并鉴定人NSPc1慢病毒过表达系统,以便应用过表达技术进一步研究NSPc1功能.方法 设计针对人NSPc1cDNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的pLenti6-TO-EGFP-TRIP载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒,转染293T细胞并用Western blot检测质粒过表达效果.用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用Western blot检测慢病毒系统过表达效果.结果 证实人NSPc1正确插入慢病毒载体,人NSPc1慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达NSPc1.结论 人NSPc1慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人NSPc1功能打下了基础.
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神经干细胞增殖与分化过程中Bmi1与NSPc1的作用
多梳蛋白(PcG)家族是非常保守的表观遗传调节因子.近年来对其成员的功能研究发现,PcG家族对干细胞的自我更新及增殖与分化都有很重要的作用.哺乳动物PRC1成员Bmi1和NSPc1在神经系统发育早期高表达.近的研究提示它们不仅在细胞增殖分化相关基因转录调控中发挥重要作用,而且在神经干细胞自我更新及分化过程中同样有重要作用.
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NSPc1-siRNA重组慢病毒的构建及其对U87细胞NSPc1基因的沉默效应
[目的]构建包装NSPc1-siRNA慢病毒颗粒,并在 U87胶质瘤细胞中鉴定其感染及基因沉默效果.[方法]根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备合成GV118-siRNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒颗粒在目的细胞U87胶质瘤细胞中的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blotting方法检测NSPc1 siRNA慢病毒对U87中NSPc1的干扰作用.[结果]成功构建NSPc1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,重组病毒滴度为4×108 TU/ml;用该病毒体外感染U87胶质瘤细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90％; RT-PCR和Western blotting方法检测NSPc1基因沉默的效率分别为66.4％、60.0％.[结论]成功构建了NSPc1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,该重组病毒包装后在体外感染U87胶质瘤细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果.
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胶质瘤细胞H4中与多梳蛋白NSPc1相互作用的长链非编码RNA的鉴定
[目的]鉴定胶质瘤H4细胞系中与多梳家族(polycomb group)蛋白NSPc1可能相互作用的长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA).[方法]在胶质瘤H4细胞系中,利用RNA结合蛋白免疫共沉淀RIP(RNA binding protein immunoprecipita-tion,IP)技术联合实时定量PCR技术在生物信息学预测与NSPc1蛋白结合评分较高的候选lncRNAs中验证相互作用的ln-cRNAs.[结果]鉴定出MALAT1、MEG3和SOX20T可能与NSPc1蛋白相互作用.[结论]胶质瘤细胞中多梳蛋白NSPc1可能通过与lncRNAs相互作用参与着肿瘤的发生发展、迁移、侵袭甚至肿瘤干细胞干性的维持.
