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人Polycomb家族成员NSPc1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备
目的 Polycomb家族成员NSPc1多克隆抗体的制备与检测.方法 应用PCR技术扩增人NSPc1编码区全长序列并插入到pET-43.1a(+)载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白HIS-NSPc1.利用所表达的融合蛋白中含有的6×His标签进行亲和纯化.用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人NSPc1多克隆抗体.用Western blot检测抗体免疫反虚的特异性.结果 在大肠杆菌中表达并纯化了人NSPc1重组蛋白,纯度达95%,用其免疫新西兰大白兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blot实验中该抗体可以特异识别内源及外源性NSPc1蛋白.结论 原核表达的NSPc1融合蛋白可以被纯化,并具有足够的蛋白免疫原性,所制备的相应多克隆抗体具有良好的特异性,可以运用于NSPc1基因的功能研究.
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神经干细胞增殖与分化过程中Bmi1与NSPc1的作用
多梳蛋白(PcG)家族是非常保守的表观遗传调节因子.近年来对其成员的功能研究发现,PcG家族对干细胞的自我更新及增殖与分化都有很重要的作用.哺乳动物PRC1成员Bmi1和NSPc1在神经系统发育早期高表达.近的研究提示它们不仅在细胞增殖分化相关基因转录调控中发挥重要作用,而且在神经干细胞自我更新及分化过程中同样有重要作用.
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多梳蛋白4与肝癌生存期密切相关
据“健康报”2014年2月11日报道,上海交通大学医学院细胞分化和凋亡教育部重点实验室陈国强教授领衔的课题组科研人员历时6年,在多梳蛋白4(Cbx4)干预肝癌组织新生血管生成研究方面取得突破,相关研究论文日前发表在国际学术刊物《癌细胞》杂志上。专家认为,Cbx4与肝癌病人的生存期密切相关,有望成为临床上判断肝癌预后的指标；同时发现Cbx4通过泛素蛋白修饰调控肝癌的新生血管生成,为肝癌治疗提供新启示。陈国强课题组科研人员通过检测727位肝癌病人癌组织样本中多梳蛋白4(Cbx4)的表达,发现高表达Cbx4的肝癌病人手术后5年生存期明显低于低表达Cbx4的肝癌病人,科研人员由此提出Cbx4是独立判断肝癌病人预后的重要指标。在此基础上,科研人员又进一步发现,Cbx4的表达水平与血管内皮生长因子(VEGF)的表达及新生血管密度呈高度正相关,即在多种皮下与原位肝癌实验小鼠模型中,Cbx4高表达促进VEGF的产生、新生血管生成和肿瘤的生长与转移；反之,抑制Cbx4表达则明显抑制甚至阻止肝癌细胞在小鼠体内的生长,从而揭示了Cbx4在肝癌发生、发展中的重要作用。
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多梳蛋白Nspc1对微管基因Tubulin βIII启动子活性的影响
[目的]克隆Tubulin βIII基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中并检测多梳蛋白Nspc1对其活性的影响.[方法]提取小鼠畸胎瘤细胞系P19的DNA,PCR扩增Tubulin βIII近端启动子片段,构建2个不同长度的pGL3basic-Tubulin βIII荧光素酶报告基因载体,双酶切及测序确定所扩增的DNA序列,将重组的报告基因载体与转录调控因子多梳蛋白Nspc1瞬时共转染小鼠畸胎瘤细胞系P19细胞,使用双荧光素酶报告基因检测系统检测Nspc1对Tubulin βIII启动子活性的影响.[结果]鉴定结果表明构建的Tubulin βIII启动子序列正确,P19细胞中双荧光素酶舌性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,并对转录调控因子Nspc1有应答.[结论]成功构建了Tubulin βIII荧光素酶报告基因载体,为进一步在多能干细胞分化模型中研究多梳蛋白Nspc1对Tubulin βIII基因的表达调控机制奠定了重要基础.
关键词： 多梳蛋白 Tubulin βIII启动子 荧光素酶报告基因 转录活性 -
低氧调控Sirt6的表达及其机制研究
低氧是肿瘤的重要微环境，它主要通过低氧诱导因子实现对肿瘤发生发展的调控。近，我们报道多梳蛋白CBX4通过SUMO化修饰低氧诱导因子HIF－1，进而增加其转录活性，促进肿瘤新生血管生成和肿瘤转移（ Cancer Cell，2014，25：118－131）。我们随后的研究发现，经CBX4进行SUMO化修饰的HIF－1α不能结合Sirt6。后者是去乙酰化酶sirtuin家族中的一员，也可能是HIF－1转录活性的共遏制因子。有趣的是，我们发现低氧能够下调Sirt6蛋白而非mRNA的表达。通过siRNA技术分别将低氧下发挥重要作用的两个转录因子HIF－1α／HIF－2α进行knockdown后发现，HIF－2α而不是HIF－1α介导了低氧对于Sirt6的调控。在常氧下转染HIF－2α能够剂量依赖地减少Sirt6的表达。低氧和过表达HIF－2α都能够缩短Sirt6蛋白的半衰期。同时，在分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、PS－341或溶酶体抑制剂CQ，发现Sirt6是通过蛋白酶体途径而非溶酶体途径发生降解。在此基础上，我们进一步通过双荧光蛋白检测系统寻找低氧下加速Sirt6降解的泛素E3连接酶。
