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金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠RIG-Ⅰ信号传导通路的影响
目的:研究金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的BALB/c小鼠肺组织中RIG-Ⅰ信号传导通路的影响,探讨其可能的抗病毒机制.方法:RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,不同剂量金欣口服液灌胃给药进行干预,于首次滴鼻后24 h、72 h、144 h取各组小鼠肺组织,Real time RT-PCR分别检测RSV-M、RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ和IFN-β在mRNA水平的表达情况,Western Blot检测RIG-Ⅰ和IPS-Ⅰ在蛋白水平上的表达情况.结果:RSV感染24 h和72 h后,其肺组织中RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ和IFN-β的表达均较正常组显著升高,金欣口服液不同剂量组RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ和IFN-β表达较RSV组明显下调;144 h后,RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ和IFN-β表达量显著下调,金欣口服液不同剂量组能上调RIG-Ⅰ、IPS-Ⅰ和IFN-β的低表达.结论:RSV能诱导RIG-1信号传导通路的激活从而促进IFN-β的表达,而金欣口服液能通过调控RIG-1信号通路从而调节IFN-β的表达.
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伪狂犬病毒UL54蛋白与IRF3互作抑制IFN-β启动子活性
研究伪狂犬病毒UL54蛋白对I型干扰素表达的作用及机制, 为阐明伪狂犬病毒致病机制提供基础.构建表达UL54的真核质粒, 采用双荧光素酶报告基因检测系统, 检测UL54对IFN-β及其信号通路分子IRF3和NF-κB启动子活性的影响, 并测定UL54对RIGI、TBK1、IRF3和IKKε诱导IFN-β表达的影响;免疫共沉淀方法检测UL54与IRF3的相互作用.构建UL54截短基因表达载体, 用双荧光素酶报告基因检测系统和ELISA方法检测UL54截短基因对IFN-β启动子活性的影响.构建了pCDH-UL54和8个UL54截短基因真核表达载体.UL54显著抑制IFN-β和IRF3启动子活性, 对RIGI、TBK1、IRF3、IKKε介导的IFN-β有抑制作用, 免疫共沉淀方法检测证明其与IRF3存在互作.UL54的1146aa、74361aa和84361aa截短体仍抑制IFN-β启动子活性, 但第94aa后的其他截短体基因均丧失该抑制作用.PRV UL54通过与IRF3互作抑制IFN-β启动子活性, UL54第8494位氨基酸是其抑制IFN-β表达的关键功能区域.
关键词： 伪狂犬病毒(PRV) UL54蛋白 干扰素 IFN-β 信号通路 -
病毒感染后表达下调的RNF167抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-β
目的 探讨RNF167对病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-β的调控作用.方法 RNA病毒VSV和DNA病毒HSV-1感染小鼠腹腔巨噬细胞后,Western blot检测RNF167的表达水平.利用RNA干扰减少小鼠原代腹腔巨噬细胞中RNF167的表达后,病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞,实时荧光定量PCR法检测IFN-β的mRNA水平,ELIAS法检测细胞上清中IFN-β的浓度.Western blot法检测IFN-β的转录因子IRF3的磷酸化(p-IRF3)水平.结果 VSV感染巨噬细胞4和8h后,RNF167表达水平显著下降(P＜0.01),而HSV-1感染后RNF167的表达没有显著变化.si-RNF167降低小鼠腹腔巨噬细胞RNF167表达水平后,与对照细胞相比,感染RNA病毒后细胞中IFN-β的mRNA水平及上清中IFN-β水平显著下降(P＜0.01),p-IRF3水平也显著下降.而感染HSV-1病毒后上述指标均无差异.结论 RNF167能够特异性地调控RNA病毒感染的巨噬细胞中IFN-β的表达.
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干扰素-β对不同胶质瘤细胞系的生长抑制及对其他细胞因子表达调节作用的研究
目的:研究干扰素-β(IFN-β)对胶质瘤细胞系的生长抑制和诱导凋亡作用,及其对细胞因子表达的调节作用.方法:分别用IFN-β基因和蛋白刺激胶质瘤细胞系SK-MG-1和T-98,通过MTT方法检测细胞增殖情况,运用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,用实时定量PCR法检测细胞因子的表达变化.结果:IFN-β基因和蛋白可明显抑制SK-MG-1细胞增殖,诱发细胞凋亡,但对T-98细胞系的作用很弱.SK-MG-1细胞的对照组不能检测出白细胞介素-1β(IL-1β)的表达,在48h达到42.8±8.3;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在IFN-β基因刺激后24 h其表达达到10±2.1,P=0.001;IFN-β基因刺激后白细胞介素IL-6的表达在12 h一过性降低(0.2±0.1),P=0.001,在48 h其表达升高(9.7±1.3),P=0.000.T-98细胞的对照组不能检测出肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,在刺激48 h达到5.7±2.7;白细胞介素-1β(IL-1β)在IFN-β基因刺激后12 h表达达到6.8±1.1,P=0.002;白细胞介素-6(IL-6)表达在IFN-β基因刺激后,24 h升高(2.8±0.4),P=0.030.结论:IFN-β基因和蛋白可以抑制胶质瘤细胞的增殖,诱发细胞的凋亡,可以调节其他细胞因子的表达.但是在不同的细胞系中有不同作用.
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线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达质粒的构建及表达
目的:构建线粒体抗病毒信号蛋白(mitoehondrial antiviral signaling protein,MAVS)真核表达质粒.方法:从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得MAVS的全长cDNA双链片段.经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆进行测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-MAVS.借助脂质体转染peDNA3/flag-MAVS质粒到HEK293T细胞中,用Westem印迹检测目的蛋白的表达.同时用β干扰素的荧光素酶报告基因(IFN-β-luc)检测MAVS蛋白活性.结果:Western印迹实验证明pcDNA3/flag-MAVS可以在HEK293T细胞中表达MAVS,并且能使IFN-β报告基因活性明显增强.结论:构建了重组质粒peDNA3/flag-MAVS,在细胞中表达MAVS后具有刺激IFN-β转录的生物活性.
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针刺对脑缺血再灌注大鼠梗死灶边缘区顶叶皮质TLR9、TNF-α、IRF7和IFN-β的mRNA表达的影响
[目的]检测脑缺血再灌注模型早期梗死灶边缘区Toll样受体9(TLR9)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素-β3(IFN-β3)的mRNA表达,阐明针刺对脑梗死的TLR9通路作用机制.[方法]使用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血模型,缺血90 min后行再灌注,治疗组予针刺干预,于再灌注6h、5d后将大鼠取材,进行荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测,观察局灶性脑缺血模型大鼠脑组织TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β3的mRNA表达及针刺的干预作用.[结果]针刺能明显增强神经保护因子IFN-βmRNA的表达(P＜0.05).TLR9信号通路mRNA的表达对比均无统计学差异(P＞0.05).[结论]本针刺法治疗脑梗死通过增强神经保护因子IFN-β3mRNA的表达,改善脑缺血再灌注造成的神经功能活动障碍.本研究尚不能表明该针刺法能抑制TLR9信号通路mRNA的表达.
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IFN-β和angiostatin对猪淋巴管内皮细胞生成的影响
目的 探讨IFN-β和angiostatin分别在离体和在体条件下对淋巴管内皮细胞生成的影响.方法 淋巴管在体抑制实验观察活体被切断的淋巴管应用抑制因子后的再生情况,应用光镜、透射电镜、共聚焦显微镜观察离体猪胸导管内皮细胞的形态结构,应用MTT法来确定IFN-β对淋巴管内皮细胞生成的抑制作用,采用Hoechst法检测细胞凋亡.结果 手术切断兔前或后肢淋巴管5d后,生理盐水侧的淋巴管已愈合,angiostatin侧仍有大量染料渗漏.培养的胸导管内皮细胞的突出结构特点是胞质内有较多吞饮小泡以及从细胞膜上发出许多长突起.MTT法去显示IFN-β对离体淋巴管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用,IFN-β可引起细胞凋亡.结论 Angiostating对在体淋巴管的愈合有抑制作用,IFN-β对离体淋巴管内皮细胞的增殖有明显的抑制作用并促进细胞凋亡.
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模式识别受体TLR3、RIG-I和MDA5在慢性乙肝患者外周血的表达水平
目的:观察慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中单个核细胞胞膜和胞质模式识别受体mRNA的表达表达水平.方法:54例慢性乙型肝炎患者为实验组,40例健康体检者为对照组.采集实验组和对照组的新鲜空腹抗凝血,分离单个核细胞,提取单个核细胞中RNA,并反转录为cDNA,应用实时定量PCR技术检测Toll样受体3(TLR3)、维甲酸诱导基因-I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关分子5(MDA5)、I型干扰素(IFN-α、IFN-β)、转录因子3(IRF-3) mRNA表达水平.结果:与正常对照组比较,实验组的TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA表达水平均明显降低,具有显著性差异(P＜0.05).高病毒载量组中的各分子表达水平与低病毒载量组和健康对照组比较降低更明显,且TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3mRNA水平分别与HBV-DNA的含量呈负相关(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573).结论:细胞胞膜(TLR3)和胞质(RIG-1、MDA5)模式识别受体、IFN-a、IFN-β、IRF-3 mRNA水平在慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞中的表达降低,可能与HBV感染的慢性化状态有关.
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HMGB1在急性脑梗死患者外周血中的表达及其免疫学作用
目的:观察急性脑梗死患者高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达及其与IFN-β、IL-6浓度的相关性,初步探讨分析HMGB1在急性脑梗死免疫炎性损伤中的可能作用.方法:分别应用流式细胞术、RT-PCR、ELISA法测定49例急性脑梗死患者的外周血单个核细胞HMGB1蛋白表达、HMGB1mRNA表达及血清IFN-β、IL-6浓度,同时设置动脉粥样硬化组及健康对照组.结果:急性脑梗死组HMGB1蛋白表达、HMGB1mRNA表达、血清IFN-β及IL-6浓度均显著高于健康对照组和动脉粥样硬化组(P<0.01);HMGB1蛋白表达与IFN-β、IL-6浓度呈正相关(r=0.833、0.634).结论:急性脑梗死患者外周血单个核细胞HMGB1蛋白表达上调,进而通过其下游配体增加炎性因子分泌,介导脑缺血免疫炎性损伤.
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Rab7GTPase负向调节巨噬细胞中poly I:C诱导的细胞因子的表达
目的:通过构建Rab7的失活突变载体tRab7(Rab7T22N),研究Rab7失活突变后对poly I:C诱导的RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的影响.方法:利用PCR定点突变法构建Rab7的失活突变载体Rab7T22N,将Rab7的真核表达载体及其突变体tRab7通过脂质体法瞬时转染RAW264.7细胞,通过Western blot方法检测Rab7的表达情况.poly I:C刺激转染细胞不同时间后检测细胞因子IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达变化.结果:Western blot检测结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,转染Rab7和tRab7的细胞中Rab7的蛋白水平显著增高.Rab7过表达后,抑制了巨噬细胞RAW264.7中poly I:C刺激后IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的产生,而Rab7失活突变体tRab7(Rab7T22N)过表达后显著促进了IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达.结论:Rab7抑制了poly I:C刺激的巨噬细胞中IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达,该抑制作用依赖于其GTP结合活性.本研究为进一步阐明Rab7在TLR3信号转导通路中的作用奠定了基础.
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Rab5a促进CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达
目的：采用稳定表达Rab5a及其显性负性突变体Rab5aN133I的巨噬细胞系RAW264.7，研究Rab5a及其突变体过表达后对 CpG 诱导的炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达的影响。方法：通过脂质体法将 Rab5a 及其突变体Rab5aN133I的真核表达载体转染到RAW264.7细胞中，用G418选择性培养基进行筛选，建立稳定表达Rab5a、Rab5aN133I的细胞系。通过RT-PCR、Real time-PCR和Western blot方法鉴定稳定表达的细胞系。用CpG刺激稳定表达Rab5a、Rab5aN133I的细胞系8 h后检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的表达量变化。结果：RAW264.7转染Rab5a真核表达载体后Rab5a的表达量显著高于对照质粒转染细胞（ P＜0.05）。 Rab5a过表达后，在CpG刺激作用下RAW264.7分泌的TNF-α、IL-1β显著升高（P＜0.01），IFN-β的分泌也显著升高（P＜0.05），而Rab5aN133I过表达后上述细胞因子的分泌均有所恢复。结论：Rab5a促进了 CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达，Rab5a可能是TLR9信号通路的正向调控蛋白。
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TLR4介导的BV-2细胞抗HCV固有免疫应答机制初步研究
目的:观察BV-2细胞感染HCV后IFN-β、IL-6分泌和TLR4表达相关性,初步探讨TLR4是否介导参与中枢神经系统抗HCV固有免疫应答及其可能机制.方法:将BV-2细胞接种于24孔培养板,贴壁后换用含20%HCV阳性血清的培养液感染细胞,为HCV实验组,同时设正常血清组和空白对照组.应用流式细胞术检测各组BV-2细胞TLR4蛋白水平的表达;用RT-PCR观察阻断TLR4后各组BV-2细胞TLR4mRNA表达变化;用ELISA检测阻断TLR4后各组BV-2细胞IFN-β、IL-6分泌变化.结果:HCV实验组TLR4表达和IFN-β、IL-6分泌均高于正常血清组及空白对照组(P＜0.01);阻断TLR4的HCV实验组TLR4mRNA表达及IFN-β、IL-6分泌明显低于非阻断组(P＜0.01).结论:HCV感染中枢神经系统后,TLR4可通过启动下游细胞因子IL-6、IFN-β等的转录和翻译,介导参与宿主抗HCV固有免疫应答过程.
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单疱病毒性脑炎小鼠中TLR4和IFN-β表达的研究
目的:通过检测TLR4和IFN-β在单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)小鼠脑组织中的表达,为探讨TLR4在HSE发病中可能的免疫学作用奠定基础.方法:采用颅内接种法建立HSE小鼠模型并设置盐水组、正常组对照,分别应用RT-qPCR、RT-PCR方法检测小鼠脑组织中TLR4、IFN-β的相对表达并采用Pearson相关分析两者相关性.结果:HSE小鼠脑组织中TLR4、IFN-β的相对表达较对照组明显上调(P＜0.01),TLR4和IFN-β表达呈正相关(r=0.851,P＜0.01).结论:TLR4可能会通过启动下游细胞因子IFN-β等介导宿主在HSE中的免疫应答作用.
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Mx1蛋白在颅内感染患者外周血中的表达及其作用初探
通过检测颅内感染患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Mx1蛋白表达,探讨Mx1蛋白对颅内感染患者可能的免疫学作用及临床价值.应用流式细胞术、ELISA分别检测58例颅内感染患者(病毒性脑膜炎35例、化脓性脑膜炎23例)及16例健康对照组人群PBMC中Mx1蛋白表达及外周血中IFN-α、IFN-β分泌水平.结果显示病毒性脑膜炎组Mx1蛋白表达及IFN-α、IFN-β分泌均高于化脓性脑膜炎组患者及健康对照组人群(P＜0.01);而化脓性脑膜炎组与健康对照组人群之间无统计学差异(P＞0.05).病毒性脑膜炎患者PBMC中Mx1蛋白表达上调,其可能参与了中枢神经系统抗病毒免疫过程,同时会为鉴别病毒性脑膜炎与化脓性脑膜炎提供一定临床帮助.
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IFN-β通过抑制OPN介导Th17分化缓解EAE发病
本研究探讨IFN β对MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的免疫调节作用.通过MOG3555肽段免疫C57/BL6小鼠,建立EAE动物模型,探究IFN-β治疗EAE的作用机制.小鼠随机分为对照组和治疗组,对照组小鼠建模后隔天皮下注射无菌PBS溶液,治疗组小鼠从建模后第3天开始隔天皮下注射1×104 IU的IFN-β.随后,我们每天观察小鼠疾病进程,检测外周免疫器官和脑、脊髓中的Th1/Th17细胞亚群比例,并进一步检测了脾脏细胞培养上清中相关细胞因子、转录因子的表达以及在体外1FN β处理对Th 17分化的影响.与对照组相比,IFN-β治疗组小鼠外周免疫器官和脑、脊髓中Th1和Th17细胞均有明显下降;脾脏细胞培养上清中相应细胞因子IFN-γ、IL-17、OPN的水平明显降低,相关转录因子的表达也明显降低;体外分化实验显示IFN-β可抑制Th17的分化,并可通过抑制OPN诱导的Th17细胞的分化.上述结果提示IFN-β可通过抑制OPN调节Th17分化而缓解EAE疾病进程.
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抗胶原Ⅱ功能域抗体诱导的RA样小鼠模型的建立及其免疫病理学指标分析
应用IFN-β药物干预由抗胶原Ⅱ功能域抗体诱导建立的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)样小鼠模型(CAIA),揭示RA发病可能的新靶点以及为将IFN-β药物用于RA患者以调节其免疫功能紊乱和骨代谢失衡提供新的理论和实验依据.本研究采用不同浓度的抗胶原Ⅱ功能域抗体诱导BALB/c小鼠,建立RA样动物模型,通过观察其外观、关节评分以及番红固绿和HE染色并与正常对照组比较来评估该模型的成功建立;采用RT-PCR和免疫组化等技术检测各组模型小鼠与免疫功能紊乱和骨质破坏密切相关的MMP-3、MMP-3/TIMP-1、RANKL及c-Fos分子的表达水平.研究发现CAIA组模型小鼠上述各炎症分子的表达均显著高于对照组小鼠,同时利用重组鼠源性IFN-β调控该模型,发现其能缓解CAIA小鼠的发病情况,证明IFN-β具有使RA样小鼠免疫功能重建以及阻抑模型小鼠骨破坏的生物学作用,为进一步深入研究其调控机制和尽快将IFN-β用于临床RA的治疗奠定了实验基础.
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干扰素应用对甲状腺功能的影响及其处理
一、干扰素的作用机制目前一般将IFN分为I型和Ⅱ型2大类,I型IFN主要包括IFN-α和IFN-β,Ⅱ型即IFN-γ.IFN-α主要由巨噬细胞产生,IFN-β主要由成纤维细胞产生,它们具有相似的生物学活性,与相同的细胞受体结合;IFN-γ则主要由T细胞和NK细胞产生,其理化性质及生物学活性与I型IFN明显不同.IFN具有广谱抗病毒作用,它能通过抑制病毒的增殖,使病毒增殖量减少、受感染细胞损伤程度降低.IFN也具有很强的免疫调节作用,可以调节T、B淋巴细胞的功能.
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国产5%咪喹莫特乳膏治疗尖锐湿疣五年临床回顾
咪喹莫特(imiquimod)是一种新型的免疫调节剂,局部外用后可以诱导人外周血单核细胞和角质形成细胞产生IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-12等细胞因子,刺激机体的免疫系统产生针对感染人乳头瘤病毒(HPV)细胞的Th1型免疫反应,终清除局部HPV感染,达到治疗目的[1].现对国产5%咪喹莫特乳膏(四川明欣药业生产,商品名明欣利迪)上市5年来有关治疗尖锐湿疣的疗效及安全性观察的中文文献进行复习,为临床合理用药提供依据.
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棕榈酸对C2C12细胞Toll样受体及其炎症因子表达的影响
目的:探讨棕榈酸(PA)刺激对C2C12细胞Toll样受体(TLRs)及其炎症因子表达的影响,初步分析TLRs介导的免疫性炎症与胰岛素抵抗(IR)的关系.方法:不同浓度PA与C2C12细胞体外共培养16h,测定细胞葡萄糖消耗量以确定IR细胞模型成型情况.荧光定量PCR法测定IR细胞TLR1～5 mRNA表达情况,ELISA法测定细胞培养液中炎症因子TNF-α、IFN-β的含量.结果:PA刺激能明显降低C2C12细胞的葡萄糖消耗量,表现为IR.PA并可诱导C2C12细胞TLR2、TLR4 mRNA高表达,使TNF-α、IFN-β分泌增加,而对TLR1、TLR3、TLR5 mR-NA表达无明显影响.结论:TLR2、TLR4信号转导通路及其启动的炎症反应可能参与了PA诱导IR形成的病理过程.
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TLR4对脑缺血再灌注小鼠海马TRIF表达的影响
目的 探讨Toll样受体4(TLR4)对脑缺血再灌注小鼠海马TRIF表达的影响.方法 采用TLR4抗体封闭阻断TLR4,Western blot和RT-PCR 检测海马TLR4蛋白、IFN-β蛋白和TLR4 mRNA表达量,免疫组化方法检测TRIF袁达变化.小鼠随机分为3组:假手术组(S组)、缺血再灌注组(I组)、TLR4阻断组(T组),各组又分1、2、3及4d 4个时间点组.结果 缺血再灌注组 TLR4 蛋白、TLR4 mRNA、IFN-β和TRIF表达水平明显高于假手术组表达水平(P<0.05),而TLR4阻断组TLR4蛋白、TLR4 mRNA、IFN-β和TRIF表达水平明显少于缺血再灌注组(P<0.05).结论 缺血再灌注可激活TLR4,并引起TRIF和IFN-β表达量增加,而采用TLR4抗体封闭阻断TLR4后,TRIF和IFN-β表达量减少.本研究提示,TLR4通过上调TRIF表达参与脑缺血再灌注的反应机制.
