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CpG ODN佐剂序列的筛选及其免疫刺激活性研究
目的 设计和筛选对入PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂. 方法 根据具有免疫刺激活性的CpG ODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰.分选健康人PBMC细胞及Balb/c小鼠脾细胞,以不同CpG ODN进行体外刺激,MTT法检测CpG ODN诱导细胞增殖水平.随后将筛选出的有效CpG ODN序列与人类基因组序列进行同源性比较,以评估其安全性. 结果 在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后,硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组,其中IMB-AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0.377和0.334,与阳性对照ISS1018序列A值(0.387和0.338)接近;刺激小鼠脾细胞72h后,A值同样高于其他序列,达到0.571和0.486,与阳性对照ISS1018序列A值(0.588和0.464)接近.综合上述结果,选择5号非硫代序列作为候选佐剂.同源性比较结果显示,该序列与人类基因组序列没有同源性,与部分蛋白编码基因的同源性只有50％ ～65％,此外其部分序列与入18号染色体上的一些重复序列有同源性,高同源性达62％.证明筛选出的新型CpG ODN佐剂IMB-AC5安全性较高.结论 设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列IMB-AC5,与人类基因组序列具有较低同源性,为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础.
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CpG ODN佐剂序列IMB-AC5的体外免疫刺激活性分析
目的 对CpG ODN候选佐剂IMB-AC5进行体外免疫刺激活性分析.方法 以目前国外进入临床研究的两种CpG ODN佐剂序列(Coley 7909和Dynavax ISS1018)为对照,采用3H-TDR法检测IMB-AC5刺激人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)的增殖活性;流式细胞术分析CD19+B活化细胞表面CD69表达水平;ELISA法检测刺激后GEN细胞产生的IL-6和IFNα.水平.结果 3种CpG ODN佐剂均能明显刺激人PBLs的增生,IMB-AC5刺激增生能力优于Dynavax ISS1018,略低于Coley 7909;IMB-AC5活化CD19+B细胞表面CD69表达水平与Coley7909相似,Dynavax ISS1018活化效果略低于前二者;3种CpG ODN佐剂体外活化树突状细胞水平差异较大,且呈明显的剂量依赖,IMB-AC5的佳活化浓度范围为0.15 ～1.5tμmol/L,Coley 7909的佳活化浓度范围为＜0.25 μmol/L,活化效果均优于Dynavax ISS1018.结论 IMB-AC5可作为有效的疫苗候选佐剂,且不低于国外同类佐剂的体外免疫刺激活性.
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我军科学家发现的新型基因库收录等7则
我军科学家发现的新型基因库收录前不久，从国际权威基因库NCBI传来喜讯：由第二军医大学药学院郭葆玉教授研究发现的新型人胸腺素原α基因被该库收入登录，并被正式命名为人胸腺素原α(Homo Sapiens Prothymosin α14 mRNA)。有关专家认为，这一重大发现，为我国新药特别是生物工程药物研究从仿制走向自我创制奠定了重要基础。 胸腺素原α是一种存在于人体内的酸性蛋白，具有广泛的生物活性。它可作为核蛋白参与细胞增殖，并具有显著的免疫刺激活性。国内外竞相将其作为研究的热点和重点。郭葆玉教授等科技人员发现的这一新型人胸腺素原α基因，由306个核苷酸组成，与国外报道的人胸腺素原α基因有86.4％的同源性。科学实验证明，它可抑制肿瘤细胞的生长，明显延长人的寿命，修复全身性红斑狼疮病人和多发性硬化症病人缺陷的单细胞刺激功能，提高免疫系统的自身稳定性。在治疗肿瘤、肝炎、免疫系统疾病等方面均具有重要的应用价值。 (张晓冬)
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重组卡介苗rBCG-Ag85A-ESAT-6对人巨噬细胞免疫刺激活性的影响
目的 探究重组卡介苗(rBCG-Ag85A-ESAT-6,rBCG-AE)对人巨噬细胞免疫刺激活性的影响,为该疫苗的应用提供重要的理论依据和实验基础.方法 将rBCG-AE(rBCG-AE感染组)及卡介苗(BCG感染组)分别感染体外培养的受PMA诱导分化的人单核细胞系(THP-1细胞株),分别于感染后24、48及72 h,观察细胞表面分子CD80和CD86的表达及细胞培养基中干扰素(IFN)-γ及肿瘤坏死因子(TNF)-a的诱生量.结果 THP-1细胞(未受PMA诱导分化的细胞)和PMA分化的THP-1细胞培养4 h后,细菌吞噬率分别为(8.45±1.54)%、(91.26±2.13)%,后者显著高于前者(P=0.01);感染后24、48及72 h,rBCG-AE组CD86阳性细胞比率分别为 (32.84±7.13)%、(48.42±5.46)%、(39.48±5.67)%,CD80阳性细胞比率分别为(20.28±1.13)%、(23.67±1.23)%、(23.19±1.58)%,均显著高于BCG感染组的CD86[分别为(28.17±5.26)%、(40.09±7.21)%、(31.26±6.85)%]和CD80阳性细胞比率[分别为(22.15±1.82)%、(23.27±1.91)%、(22.68±0.87)%],差异均有统计学意义(均P＜0.01).感染后24、48及72 h,rBCG-AE组IFN-γ诱生量分别为(1 986±156)pg/mL、(4 687±168)pg/mL、(3 238±97)pg/mL,TNF-а诱生量分别为(1 153±48)pg/mL、(5 864±97)pg/mL、(4 129±68)pg/mL,各时间点均显著高于BCG感染组的IFN-γ[分别为(1 245±32)pg/mL、(3 067±143)pg/mL、(2 879±186)pg/mL]和 TNF-а诱生量[分别为(486±18)pg/mL、(3 237±86)pg/mL、(1 068±74)pg/mL],差异均有统计学意义(均P＜ 0.01).结论 rBCG-AE可显著增强人巨噬细胞免疫刺激活性,该疫苗可作为替代BCG的候选疫苗,具有进一步开发研究的价值.
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细菌 DNA拮抗措施研究进展
细菌DNA能够激活哺乳动物巨噬细胞、树突状细胞、 B细胞以及自然杀伤细胞(NK)等多种免疫细胞,诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)1、IL-12、γ型干扰素(IFN-γ)等炎症介质释放[1],引起急性炎症反应,甚至发展为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)并导致死亡[2,3].细菌DNA免疫刺激效应的结构基础是CpG基元(CpG motif),即以未甲基化的CpG二核苷酸为核心的特定短核苷酸序列,所以细菌DNA也被称为CpG DNA.人工合成的含有CpG基元的寡核苷酸(oligonucleotide,ODN)能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性[4],故称之为CpG-S ODN(stimulatory CpG oligonucleotide).
