α2,6-唾液酸转移酶 (ST6Gal I) 的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2,6唾液酸转移酶(ST6Gal I)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响.方法结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6Gal I cDNA或反义ST6Gal I cDNA的部分序列的表达载体pcDNA3.1, 以RT-PCR检测转染子ST6Gal I mRNA的表达, 流式细胞仪检测细胞表面α2,6唾液酸含量. 结果转染正义ST6Gal I cDNA的克隆显示ST6Gal I mRNA的表达增强以及接骨木凝集素(SNA)与细胞表面成分的结合增加;而转染反义ST6Gal I cDNA的部分序列的细胞克隆的ST6Gal I mRNA的表达减少, SNA与细胞表面成分的结合力降低. 结论 ST6Gal I的表达直接影响细胞表面α2,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能. 利用反义核酸技术抑制ST6Gal I的表达并降低肿瘤细胞表面α2,6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段.

乙型肝炎病毒e抗原肝细胞结合蛋白新基因E-36基因表达谱芯片分析

目的:为了研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-36的生物学功能,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-E-36分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被E-36反式调节的靶基因.方法:应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-36蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载淋pcDNA3.1(-)-E-36.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1159个基因表达谱的筛选中,发现有20个基因表达水平显著上调,包括甲状旁腺激素应答的骨肉瘤B1蛋白、SLIT2、核因子κB、白介素受体3、白介素6、血管紧张素Ⅰ转换酶、急性髓细胞性白血病1b、caspase 2、低密度脂蛋白1、T细胞受体重组β链、肿瘤坏死因子受体、肿瘤抑制亚转化因子、细胞周期相关激酶-2、亲代谢性谷氨酸盐受体-7、唾液酸转移酶-8及5个未知蛋白;真核细胞翻译延伸因子2基因的表达水平显著下调.结论:E-36基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.

047复合唾液酸和人复合唾液酸转移酶STX的表达与非小细胞肺癌的肿瘤转移相关

丙型肝炎病毒感染人肝细胞系对多种唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶表达的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染人肝癌细胞系Huh7.5.1细胞后与肿瘤相关的唾液酸转移酶家族和半乳糖基转移酶家族的35个糖基转移酶的表达变化.方法 利用HCV感染的Huh7.5.1肝细胞模型,采用Western blot检测HCV感染后HCV非结构蛋白NS3的表达,定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测HCV感染后HCV-RNA的表达及HCV感染对Huh7.5.1细胞中35个糖基转移酶mRNA表达水平的影响.凝集素染色实验测定HCV感染对Huh7.5.1细胞中糖苷表达水平的影响.结果 在HCV感染后的Huh7.5.1 细胞中,发现4 个唾液酸转移酶(ST3Gal Ⅲ、ST6GalNAC Ⅲ、ST8Sia Ⅲ和ST8Sia Ⅳ)和5个半乳糖基转移酶(B3GALT 1、B3GALT 2、B3GALT 3、B3GALT 4和B4GALNT 2)的mRNA水平明显升高11~45倍,其中变化大的是B3GALT 1,上升45倍,其次是ST8Sia Ⅲ和ST8Sia Ⅳ,分别上升37倍和39倍.进一步采用凝集素染色实验验证,发现结合末端唾液酸糖苷Neu5Acα6Gal的接骨木凝集素(elderberry lectin,EBL)在HCV感染后升高1.97倍,结合末端半乳糖苷Galβ1,3GalNAc的尾穗苋凝集素(amaranthus caudatus agglutinin,ACA)和结合Galβ1,4GalNAc的鸡冠刺桐凝集素(erythrina cristagalli agglutinin,ECA)分别升高3倍和4.3倍.结论 HCV感染导致人肝细胞中特定唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶及其相应糖苷表达水平呈现明显上升.这些结果对研究HCV感染的治疗靶点和诊断标志物具有一定参考价值.

瑞舒伐他汀减轻ApoE-/-小鼠动脉硬化形成与ST6 Gal-Ⅰ表达相关性研究

目的：探讨瑞舒伐他汀抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成是否与唾液酸转移酶( ST6Gal-Ⅰ)的表达相关。方法取ApoE-/-小鼠,分别采用高脂喂养16周(基线模型组,baseline)、高脂喂养23周(对照组,control)及高脂喂养23周且瑞舒伐他汀灌胃7周(药物组,rosuvastatin)构建模型。分别测定3组ApoE-/-小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯( TG)的含量及主动脉斑块面积,分析动脉粥样形成的病理变化,确定高胆固醇血症模型成立。通过免疫组织化学法分析主动脉内膜中ST6Gal-Ⅰ的表达。结果对照组与基线组相比,随着高脂饲料喂养周数增加,小鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG均增加,其中LDL-C及TG变化差异具有显著性(P<0．05),其动脉弓斑块面积明显增大(P<0．05),管腔内膜明显增厚(P<0．05),说明高胆固醇血症模型构建成功。而瑞舒伐他汀处理药物组与对照组比较,血脂四项指标、斑块面积均有所下降,且LDL-C、TG水平及斑块面积变化差异均有统计学意义( P<0．05)。分别检测3组ST6Gal-Ⅰ表达显示对照组较基线组动脉弓处表达上调,用药后ST6Gal-Ⅰ表达明显下调。结论瑞舒伐他汀预防小鼠动脉粥样硬化形成的机制可能与ST6Gal-Ⅰ表达密切相关。

莪术对正常和血瘀证孕大鼠子代海马ST8Sia Ⅱ和黏着斑激酶表达的影响

目的 观察莪术对正常和血瘀证大鼠子代海马神经粘附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM)、ST8Sia Ⅱ、ST8Sia Ⅳ、p-Fyn、黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)蛋白表达的影响.方法 采用大鼠皮下注射盐酸肾上腺素及冰水浴复制大鼠血瘀证模型.于妊娠第6d～19d灌胃给予莪术水煎液.取仔鼠海马,采用Western blot检测NCAM、ST8Sia Ⅱ、ST8Sia Ⅳ、p-Fyn、p-FAK蛋白表达.结果 正常大鼠和血瘀证大鼠莪术给药后子代海马NCAM、ST8Sia Ⅱ、p-Fyn蛋白表达存在差异.高剂量莪术对正常孕大鼠子代海马NCAM、ST8Sia Ⅱ、p-Fyn蛋白表达具有抑制作用.结论 莪术对正常孕大鼠子代海马NCAM、ST8Sia Ⅱ、p-Fyn蛋白表达的抑制作用可能是莪术发育毒性的机制之一.

反义寡核苷酸对Daudi细胞α2,6唾液酸的下调作用研究

目的研究反义寡核苷酸对Burkitt's淋巴瘤Daudi 细胞α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal I)的活性和细胞表面α2,6-唾液酸水平的下调作用.方法以修饰后的ST6Gal I的反义寡核苷酸处理Daudi细胞,以RT-PCR 检测Daudi细胞ST6Gal I mRNA的表达,荧光定量法测定ST6Gal I的活性及以流式细胞仪检测细胞表面α2,6-唾液酸的含量.结果和对照组比较,以反义寡核苷酸处理的Daudi细胞ST6Gal I mRNA的表达下调,ST6Gal I酶活性下降,并导致细胞表面α2,6-唾液酸水平降低.结论反义寡核苷酸可有效降低Daudi细胞表面α2,6-唾液酸化水平,内源性减少α2,6-唾液酸对Daudi 细胞CD22受体的屏蔽作用.

靶向ST6GalⅠ的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6GalⅠ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染SW480细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA+ASO1组及siRNA+ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠ Mrna水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力.结果 siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA+ASO1组、siRNA+ASO2组中,SW480细胞的ST6GalⅠ Mrna表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P＜0.05),以siRNA+ASO1组明显,且siRNA+ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而siRNA+ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.

细胞表面唾液酸及其连接方式对乳腺癌细胞黏附的影响

目的研究肿瘤细胞总唾液酸及α2,6-连接唾液酸对乳腺癌细胞MDA-MB435黏附力的影响.方法乳腺癌细胞MDA-MB-435转染顺义或反义α2,6唾液酸转移酶(ST6Gal-Ⅰ)cDNA,以黑接骨木凝集素SNA筛选高、低表达α2,6唾液酸细胞克隆,检测各转染细胞的同源凝集作用,并比较唾液酸酶处理前后肿瘤细胞对胶原Ⅳ黏附力的变化.结果顺义转染克隆细胞-细胞之间的同源黏附能力下降,与胶原Ⅳ的黏附增强;反义转染克隆细胞-细胞之间同源黏附能力增强,而与胶原Ⅳ的黏附降低.唾液酸酶处理后肿瘤细胞与胶原Ⅳ的黏附力下降至未处理前的31%～57%.结论乳腺癌MDA-MB435细胞表面唾液酸及α-2,6唾液酸化对肿瘤细胞的黏附有重要影响.

α2,6-唾液酸对结肠癌细胞同源凝集的影响

目的研究结肠癌细胞LS174T的α2,6-连接的唾液酸水平对肿瘤细胞同源黏附功能的影响.方法结肠癌细胞株LS174T转染α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-I)cDNA或ST6Gal-I cDNA的部分反义序列以及空载体pcDNA3.1,以流式细胞仪检测转染细胞表面α2,6-连接唾液酸含量并进行克隆分选,比较顺义、反义以及空载体转染细胞的贴壁时间以及细胞-细胞之间的同源凝集效应.结果转染顺义的ST6Gal-I cDNA的细胞克隆显示ST6Gal-ImRNA的表达增强,SNA(一种特异性识别α2,6-连接唾液酸的植物凝集素)与细胞表面成分的结合增加;另一方面,细胞转染反义ST6Gal-I cDNA后其ST6Gal-I mRNA表达减少,SNA与细胞表面成分的结合力降低.与空载体转染相比,顺义转染的细胞克隆同源凝集作用降低,与细胞外成分的黏附作用增强,贴壁速度加快;反义转染细胞克隆同源凝集作用显著增强,与细胞外成分的黏附作用降低,传代后4 h的贴壁率仅为空载体的53.7%.结论本实验结果显示,肿瘤细胞α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal-I)的表达将有效影响细胞表面α2,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的黏附功能.

靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA与ASO联合应用对宫颈癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与反义寡核苷酸(ASO)联合应用对ST6Gal Ⅰ高表达的宫颈癌HeLa细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染HeLa细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA相同靶点)、ASO2组(与siRNA不同靶点)、siRNA+ASO1组及siRNA+ASO2组,用RT-PCR测定细胞中ST6Gal Ⅰ mRNA水平,流式细胞仪检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)的粘附与侵袭力.结果 转染后各实验组细胞的ST6Gal Ⅰ mRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均低于空白对照组及脂质体对照组(P均＜0.05),以siRNA+ASO2组调低作用明显.其中siRNA组细胞的ST6Gal Ⅰ mRNA表达水平(0.55±0.08)、细胞表面α2,6-唾液酸含量(39.27±9.23)分别与siRNA+ASO1组(0.54±0.09、38.27±7.74)比较,差异均无统计学意义,与siRNA+ASO2组(0.33±0.09、9.10±0.40)比较,差异有统计学意义(P均＜0.05);siRNA组与siRNA+ASO1组比较,细胞对ECM的粘附与侵袭力差异均无统计学意义,而siRNA+ASO2组细胞对ECM的粘附与侵袭力较siRNA组降低(P均＜0.05).结论 化学合成的靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA能够下调HeLa细胞中ST6Gal Ⅰ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.

ST6Gal I 基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal I)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6Gal I高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响.方法:设计并合成ST6Gal I靶向的siRNA, 用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染SW480细胞.实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6Gal I siRNA组, 采用RT-PCR测定细胞中ST6Gal I mRNA表达水平, 流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量, 并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒, 检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力.结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比, 转染48 h后, ST6Gal I siRNA组细胞中ST6Gal I mRNA表达明显下调;转染72 h后, ST6Gal I siRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P＜0.05).结论:化学合成的靶向ST6Gal I的siRNA能够下调SW480细胞中ST6Gal I基因的表达, 降低细胞对ECM的黏附和侵袭力.本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础.