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雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建
目的 探讨构建雌激素受体α(ERα)亚基基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的方法,为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据.方法 利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA,体外合成siRNA基因,并将其定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建真核表达载体.采用PCR扩增、酶切分析鉴定.结果 双酶切法鉴定重组质粒后,RT-PCR法鉴定ERαsiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达.结论 ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建,为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据.
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瘦素对成骨样细胞MG63增殖功能的影响
近研究发现,肥胖患者发生骨质疏松症的危险性明显较非肥胖者为低,且肥胖往往伴有血清瘦素(leptin, LP)的明显升高,提示LP可能参与骨代谢的调节[1,2].我们于2003年11月至2004年6月对LP对人成骨样细胞MG63(human osteoblast-like cell line MG63, MG63)增殖功能的影响进行检测,以探讨LP调控骨量的机制.
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阿仑膦酸钠对人成骨样细胞增殖和分化的影响
目的:研究阿仑膦酸钠对人成骨样细胞增殖和分化的影响.方法:进行OS-732人成骨样细胞生长曲线的绘制、MTT测定、形态学观察、碱性磷酸酶(ALP)测定、ALP染色等.结果:①d3时,与对照组相比,10-6md@L-1浓度组的细胞数目增加22.6%;而10-5mol@L-1浓度组的细胞数目明显低于对照组.d 6时10-6,10-7,10-8mol@L-1三种浓度组细胞数日比对照组分别增加24.7%,24.7%和31.0%.10-5mol@L-1浓度组的细胞数目仍明显低于对照组.MTT测定得到了类似的结果.②加药后d4,10-6,10-7,10-8mol@L-1三种浓度组的细胞与空白对照组相比细胞数目多、形态大而规则,染色质深而致密,核质比小.③ALP染色结果显示,10-6,10-7mol@L-1浓度组细胞ALP颗粒染色明显深于对照组,并且ALP颗粒在胞质中分布均匀.ALP的定量测定结果表明,10-6,10-8mol@L-1浓度组细胞ALP水平明显高于对照组.结论:阿仑膦酸钠对体外培养的OS-732人成骨样细胞具有促增殖和分化作用,并且这种作用具有适合的浓度.
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白细胞介素1受体相关激酶4基因沉默抑制人成骨样细胞相关基因的表达
背景：造成假体周围骨溶解的完整分子机制目前尚未完全清楚。假体周围骨溶解、吸收是人工关节松动的典型病理生理过程。白细胞介素1通过MAPK信号通路影响骨吸收进程。
目的：实验通过观察siRNA沉默白细胞介素1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase-4， IRAK-4)基因表达对人成骨样细胞株MG63的MAPK信号转导通路的影响，为防治人工关节置换后假体周围骨溶解提供实验基础。
方法：以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞。实验分为3组，空白组不加入任何转染试剂；对照组以 scrambled siRNA 序列进行转染；沉默组以特异性 IRAK-4-siRNA 序列进行转染。Western blot检测靶细胞细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38MAPK基因的表达。
结果与结论：与对照组相比，靶基因沉默组的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。MG63细胞 IRAK-4表达下调后，与空白组和对照组相比，c-Jun 氨基末端激酶1/2P46、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2、磷酸化p38MAPK表达下调分别为62%，64%，68%(P <0.05)。结果证实，siRNA沉默IRAK-4基因抑制人成骨样细胞株MG63细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38MAPK基因的表达。 -
雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响
背景：目前对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究较少。目的：研究雌激素受体β对人成骨样细胞骨保护素、核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)表达的影响。方法：将先前含有有效干扰序列及非特异性shRNA的反转录病毒分别感染人成骨样MG63细胞株后，筛选稳定克隆并扩大培养，以空白及非特异性shRNA作为对照，检测稳定抑制雌激素受体β的效率。分别向3组细胞即MG63细胞、雌激素受体βshRNA反转录病毒感染的MG63细胞、阴性对照shRNAnc反转录病毒感染的MG63细胞加入17β-雌二醇(E2)干预，检测人成骨样细胞株MG63的骨保护素、RANKL mRNA和蛋白表达情况。结果与结论：用pRNAT-H1.4/Retro-雌激素受体β-shRNA3进一步稳转人成骨样MG63细胞株，与空白及阴性病毒对照组相比，筛选出雌激素受体β表达稳定抑制的人成骨样细胞株，雌激素受体βmRNA 抑制率为(88.17±1.17)%(P<0.05)，蛋白抑制率为(89.01±1.22)%(P<0.05)，证实实验成功建立了人成骨样细胞ERβ亚型基因敲低细胞模型。雌激素干预48 h后，显示雌激素受体β稳定抑制的MG63细胞较空白组及阴性对照组骨保护素 mRNA及蛋白表达上调(P<0.05)，RANKL mRNA和蛋白表达下调(P<0.05)，骨保护素RANKL表达上调(P<0.05)，提示雌激素受体β可能通过调节骨保护素/RANKL在骨代谢中发挥作用。
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RNA干扰基因敲低雌激素受体β对人成骨样细胞生长的影响
目的 观察经特异性小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)下调人成骨样细胞株MG63的雌激素受体β(ERβ)后对其生长状况的影响. 方法利用计算机辅助设计并合成ERβsiRNA前体基因后,定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建重组的ERβ siRNA表达载体并测序鉴定.由脂质体介导重组质粒稳定转染入人成骨样细胞株MG-63,潮霉素筛选阳性抗性克隆细胞.RT-PCR法检测ERβ基因在人成骨样细胞株MG-63的表达,抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体法(ABC)分析ERβ蛋白在人成骨样细胞株MG-63内的表达与定位.MTT法测ERβ基因被特异性下调后对MG-63细胞生长的影响.流式细胞术分析ERβ siRNA对人成骨样细胞株MG-63细胞生长周期的影响.采用改良Gomori氏钙钴法分析ERβ siRNA对人成骨样细胞株MG-63表达碱性磷酸酶的影响.结果 构建表达ERβ siRNA的重组真核表达载体,并成功地下调了人成骨样细胞株MG-63的ERβ基因,而ERβ siRNA下调人成骨样细胞株MG-63的ERβ对细胞的生长特性无明显影响.结论 成功地构建了ERβ下调的人成骨样细胞模型,该模型为进一步研究雌激素及其受体对骨代谢影响的分子机制提供了基础材料.
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RNA干扰基因敲低雌激素受体β对雌激素诱导人成骨样细胞护骨素表达的影响
RNA干扰敲低人成骨样细胞株MG63中雌激素受体β后,RT-PCR法发现不同浓度的17β-雌二醇均能上调MG63细胞中的护骨素mRNA表达水平,其中以10-7 mol/L的作用强.而这种作用不能被G蛋白抑制剂suramin所抑制.提示雌激素受体β可能不涉及雌激素上调MG63细胞护骨素表达的调控作用.
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17β-雌二醇对MG63细胞和正常人成骨细胞雌激素受体β表达的上调作用
观察不同浓度17β-雌二醇(17β-E2)对培养MG63细胞和人成骨样细胞(HOB)雌激素受体β(ERβ)表达的影响,结果显示在MG63细胞ERβ的表达上调与17β-E2(0～1×10-6 mol/L)呈剂量依赖性关系,而在HOB细胞ERβ大表达的17β-E2的适浓度为1×10-8 mol/L.
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TRAF6在粪肠球菌感染人成骨样细胞炎症反应中的作用
目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)在粪肠球菌引发的人成骨样细胞MG63炎症反应中的作用.方法 采用siRNA瞬时干扰沉默MG63细胞的TRAF6基因,用粪肠球菌灭活全菌及其脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)刺激MG63细胞不同时间,定量PCR检测细胞中Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)和TRAF6的表达量;ELISA法检测MG63细胞产生的致炎因子白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达量.结果 粪肠球菌及其LTA感染MG63细胞,TLR2受体和TRAF6的基因水平都有不同程度的上升(P<0.05).IL-1β和TNF-α的表达量都显著增高(P<0.05).用siRNA抑制MG63细胞TRAF6表达后,促炎因子IL-1β和TNF-α的表达量显著下降(P<0.05).结论 MG63细胞主要通过TLR2受体来识别粪肠球菌及其毒性成分.粪肠球菌引起的根尖周感染中,其主要毒力因子是其细胞壁上的LTA.
关键词： 粪肠球菌 脂磷壁酸 Toll样受体2 人成骨样细胞 肿瘤坏死因子受体相关因子6 -
IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响
[目的]研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响.[方法]以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达.[结果]与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC＞Bcl-2/BaxKD;Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性.[结论]siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关.
