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转基因饲养层细胞体外促进脐带血CD34+HSPC增殖
hOSM基因饲养层细胞可以有效地扩增CD34+HSPC,并维持其较高的移植效率和造血活性.
关键词： 人抑瘤素M 反转录病毒载体 造血干/祖细胞 重度联合免疫缺陷病小鼠 -
反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达
将含全长Fas cDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除,获得sFas cDNA.通过DNA重组技术,将sFas cDNA插入到反转录病毒载体pLXIN,构建了重组表达载体pLXIN-sFas.经酶切鉴定及测序,表明成功地构建了重组表达载体pLⅪN-sFas.该载体经PA317细胞包装后,感染靶细胞COS-7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为(2.2±0.7)μg/ml,且具有良好的生物学活性,能明显抑制抗-Fas(CH-11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡.这一结果为探讨Fas和FasL途径在白血病发生中的作用奠定了基础.
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绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶在骨髓基质细胞中的表达
目的 研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白(EGFP)基因和酪氨酸羟化酶(TH)基因在原代培养的骨髓基质细胞(bMSCs)中的表达情况.方法 体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8～10 d后, 同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转染bMSCs并进行抗性筛选,7～10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,在稳定转染EGFP后10 d进行TH病毒上清的转染,7～10 d可得到稳定表达TH和EGFP的bMSCs.结果 原代培养bMSCs 3～4 d后生长至70%～80%汇合,病毒转染EGFP后第2天,细胞呈现弱荧光,经G418筛选2～3 d后出现阳性细胞,约8～10 d生长融合,阳性率60%～70%,第2～5代阳性细胞比率无明显变化.TH阳性率也达60%以上.结论 利用反转录病毒载体可有效地将EGFP和TH基因转至bMSCs中,并能在体外稳定表达传代.这种表达EGFP和TH的bMSCs对于研究bMSCs的体内迁移分化及帕金森病(PD)的基因治疗具有重要意义.
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大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定
目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450.方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成.提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因.并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定.BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450.结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因.重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1 461 bp的酶切产物.测序的结果用Clustal W在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源.阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带.对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1 461 bp和5 900 bp两条特异性条带.结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础.
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反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞
背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因.目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响.方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率.阴性对照组不做基因转移.阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株.结果与结论:①病毒滴度为1.9×108 CFU/L.②对照组BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P < 0.01).PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中.
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雌激素受体β基因沉默对成骨样MG63细胞骨保护素和RANKL表达的影响
背景：目前对雌激素β受体基因如何参与骨代谢的研究较少。目的：研究雌激素受体β对人成骨样细胞骨保护素、核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)表达的影响。方法：将先前含有有效干扰序列及非特异性shRNA的反转录病毒分别感染人成骨样MG63细胞株后，筛选稳定克隆并扩大培养，以空白及非特异性shRNA作为对照，检测稳定抑制雌激素受体β的效率。分别向3组细胞即MG63细胞、雌激素受体βshRNA反转录病毒感染的MG63细胞、阴性对照shRNAnc反转录病毒感染的MG63细胞加入17β-雌二醇(E2)干预，检测人成骨样细胞株MG63的骨保护素、RANKL mRNA和蛋白表达情况。结果与结论：用pRNAT-H1.4/Retro-雌激素受体β-shRNA3进一步稳转人成骨样MG63细胞株，与空白及阴性病毒对照组相比，筛选出雌激素受体β表达稳定抑制的人成骨样细胞株，雌激素受体βmRNA 抑制率为(88.17±1.17)%(P<0.05)，蛋白抑制率为(89.01±1.22)%(P<0.05)，证实实验成功建立了人成骨样细胞ERβ亚型基因敲低细胞模型。雌激素干预48 h后，显示雌激素受体β稳定抑制的MG63细胞较空白组及阴性对照组骨保护素 mRNA及蛋白表达上调(P<0.05)，RANKL mRNA和蛋白表达下调(P<0.05)，骨保护素RANKL表达上调(P<0.05)，提示雌激素受体β可能通过调节骨保护素/RANKL在骨代谢中发挥作用。
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神经生长因子重组反转录病毒载体在神经干细胞中的表达
背景：神经生长因子属于生物大分子，难以透过血脑屏障，而反转录病毒载体能稳定地将外源基因插入并整合到宿主细胞基因组内，适于作为基因治疗的载体。
目的：探讨神经生长因子基因重组反转录病毒表达载体在神经干细胞中的表达情况。
方法：将SD大鼠神经生长因子基因重组反转录病毒表达载体pLEGFP-NGF通过脂质体Lipofectamine 2000转染包装细胞PT67，经G418筛选后，收集阳性克隆病毒上清，用于感染神经干细胞，用ELISA检测神经生长因子基因的表达，并利用 PC12细胞检验神经生长因子的生物学活性，同时观察神经生长因子对神经干细胞存活、分化的影响。
结果与结论：重组了神经生长因子基因的反转录病毒液感染神经干细胞后能表达外源性神经生长因子蛋白，该蛋白能促使PC12细胞数量增多，突起明显变长，并能增加神经干细胞的存活数量，促进神经干细胞分化。结果说明整合了神经生长因子基因的神经干细胞能表达外源性神经生长因子，表达的神经生长因子对神经干细胞的存活及分化均有促进作用。 -
反转录病毒载体介导RNA干扰抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达
目的:课题前期发现EphA2和配体EphrinAl在宫颈鳞癌细胞和肿瘤相关血管内皮细胞均呈高表达,为基因治疗宫颈癌提供了理想的靶向.以此为基础,利用反转录病毒载体介导的RNA干扰抑制EphA2在Hela宫颈癌细胞中的蛋白表达.方法:实验于2006-01/06在河南省肿瘤病理重点实验室完成.①实验材料:PA317细胞、Hela229细胞购自上海生化细胞所,小鼠NIH3T3细胞为本室保存.EphA2兔抗人多克隆抗体,Actin兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司).②实验方法:从EphA2的mRNA全序列中筛选出1个19 nt的靶序列,设计双链发夹结构.以siRNA互补双链寡核苷酸,构建反转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,提取质粒,用BgIⅡ和EcoR Ⅰ双酶切进行鉴定.选择经酶切鉴定的正确克隆测序.挑选pSIREN-EphA2抗性克隆细胞扩增,检测转染后Hela细胞中EphA2蛋白的表达水平.结果:①pSIREN-EphA2重组质粒的酶切鉴定:双酶切后形成328 bp和6 182 bp两条电泳条带.②pSIREN-EphA2重组质粒测序:结果与已知序列完全一致.③EphA2蛋白的表达:经Western blot分析,重组pSIREN-EphA2转染的Hela细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低.结论:通过反转录病毒载体介导的RNA干扰,能够抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达,为以EphA2为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的思路和手段.
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HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞E6、E7基因表达的影响
目的:研究HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞(human immortalized oral epithelial cell,HIOEC)E6、E7基因的影响.方法:HIOEC转染pLEGFP-E5基因反转录病毒载体,同时人为突变E5基因并转染HIOEC,通过PCR检测E5及各突变体在HIOEC中的表达.实时定量PCR检测E6、E7基因mRNA水平表达量的变化以及转染后HIOEC的细胞增殖能力,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理.结果:构建了E5缺失突变体反转录病毒载体并成功转染人永生化口腔上皮细胞.转染后人永生化口腔上皮细胞的增殖行为实验表明,HPV16E5基因可促进人永生化口腔上皮细胞增殖(P<0.05),并对E6、E7基因mRNA表达具有正调控作用,但其缺失突变基因反转录病毒载体对人永生化口腔上皮细胞增殖及E6、E7表达无显著影响.结论:HPV16型E5基因可在一定程度上促进人永生化口腔上皮细胞增殖,并对E6、E7基因mRNA表达量有一定的间接上调作用.
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小鼠microRNA-31反转录病毒载体重组质粒的构建及鉴定
目的:以pMSCV-puro载体(MGP)为骨架,构建带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的小鼠microRNA-31(miR-31)反转录病毒载体MGP-31.方法:PCR扩增带有NotⅠ以及XhoⅠ酶切位点的miR31的前体(premiR-31)序列,然后克隆至MGP载体上,测序鉴定.将构建的MGP-31质粒转染HEK-293T细胞,通过荧光显微镜观察GFP的表达情况,实时定量PCR检测miR-31转录水平以评估MGP-31质粒的转染效率.结果:基因序列分析显示pre-miR-31基因序列正确,并成功插入MGP载体,转染HEK-293T细胞可表达GFP,实时定量PCR结果表明转染MGP-31质粒的HEK-293T细胞可高表达miR-31.结论:MGP-31反转录病毒载体构建成功.
关键词： microRNA-31 反转录病毒载体 重组质粒 -
反转录病毒载体的研究进展
目前基因治疗的病毒载体系统是广泛的目的基因转移系统之一,而反转录病毒载体基因结构清晰、简单,而且病毒较小,还能够被改造和操作,插入外源基因的容量相对较大,插入较大片段后仍有完全的感染性；反转录病毒的基本骨架是Moloney小鼠白血病病毒,各种机制通常同时在细胞中起作用,广泛地用于基因治疗、基因传递等方面.本文对病毒载体反转录的优劣、构造进行综述.
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人脐静脉内皮细胞永生化及生物学特性的研究
目的 建立永生化人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系并探讨永生化对HUVECs增殖、凋亡及成瘤性影响.方法 扩增并提取猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)和人端粒酶反转录酶催化亚基(hTERT)基因,反转录病毒载体介导感染HUVECs;筛选2周;聚合酶链反应(PCR)扩增后行琼脂糖凝胶电泳成像鉴定目的基因是否转入HUVECs;细胞计数法比较细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、裸鼠成瘤实验检测细胞恶性转化.结果 筛选出抗嘌呤霉素阳性克隆,SV40LT、hTERT成功转入HUVECs;永生化组细胞生长曲线上移,细胞增殖第5、6、7天,SV40LT永生化组及hTERT永生化组与HUVECs组细胞数目差异有统计学意义(P＜0.05),hTERT永生化组和HUVECs组细胞数目差异有统计学意义(P＜0.05);HUVECs组细胞总凋亡率为(11.2±0.9)％,SV40LT永生化组HUVECs总凋亡率为(3.4±0.4)％,hTERT永生化组HUVECs总凋亡率为(2.8±0.4)％,SV40LT永生化组、hTERT永生化组凋亡率均低于HUVECs组(均P＜0.05);两种永生化细胞株不具成瘤性.结论 SV40LT、hTERT基因能使HUVECs发生永生化,永生化HUVECs增殖能力增强,凋亡率下降,无恶性转化.
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肝再生磷酸酶-1稳定转染肝癌细胞株的建立及其生物学功能
目的 构建肝再生磷酸酶-1(PRL-1)真核表达载体,建立稳定过表达PRL-1的肝细胞癌Huh7细胞株,研究PRL-1在Huh7细胞中的生物学功能.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肝癌组织总RNA中扩增PRL-1基因编码区域(CDS)全长序列,与双酶切的pMSCV-PIG质粒连接,经PCR及测序鉴定pMSCV-血细胞凝集素(HA)-PRL-1载体构建成功.用293T细胞包装病毒,并感染Huh7细胞,1 mg/L嘌呤霉素持续加压筛选2周后,荧光显微镜、流式细胞仪、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及Western blot检测PRL-1在Huh7中的表达.PRL-1稳定转染细胞株构建成功后,用细胞计数试剂盒(CCK-8)法进行细胞增殖实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验研究PRL-1在Huh7细胞中的生物学功能.结果 测序结果显示克隆的PRL-1基因CDS序列完全正确,且正确插入到pMSCV-PIG载体中,荧光显微镜及流式细胞仪检测结果显示细胞稳定转染效率在90％以上,FQ-PCR结果显示PRL-1稳定转染组其mRNA表达是对照组的(4.4±1.5)倍(P＜0.05),Western blot结果显示PRL-1在Huh7细胞中过表达.CCK-8细胞增殖实验结果显示PRL-1促进Huh7细胞增殖(P＜0.01).PRL-1稳定转染细胞2周克隆形成率为(26.7±1.9)％,明显高于对照组[(7.3±0.8)％,P＜0.01].PRL-1稳定转染组较对照组侵袭细胞数量增多(P＜0.01).结论 PRL-1肝细胞癌Huh7稳定转染细胞株构建成功,PRL-1促进Huh7细胞增殖、克隆形成及侵袭.
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野生型p53基因转移对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响
目的:血管平均滑肌细胞的凋亡在球囊损伤后30分钟内即已经开始,用基因转移的方法加速这一过程是控制再狭窄的途径之一.选择野生型p53作为目的基因,观察其对血管平滑肌细胞生长及凋亡的影响.方法:构建了野生型p53基因重组反转录病毒载体pLXSN-p53.重组载体转染培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,测定转染效率和p53基因的表达,用细胞存活曲线、流式细胞仪和DNA"ladder"法检测了细胞生长和凋亡状况.结果:采用pLXSN-p53转染培养的大鼠血管平滑肌,转染效率接近100%,转染后的宿主细胞内可检测到外源性p53mRNA和外源性p53蛋白,表明基因在平滑肌细胞内获得了良好的表达.用流式细胞仪检测发现在转染后24小时,宿主细胞G1期数量明显增多,S期细胞数量减少,而且有大量的亚二倍体细胞,表现为G1期抑制和细胞凋亡.采用经典的DNA"ladder"法检测发现,宿主细胞大量凋亡.结论:以上结果说明外源性p53蛋白的表达可明显促进平滑肌细胞的凋亡.
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β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建
目的 用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株.方法 根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamH Ⅰ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体.用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株.结果 经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变.经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株.结论 成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株.
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反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达
目的 构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率.方法 使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP).将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率.结果 成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL.在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达.在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到3O%以上.结论 SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率.
