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低氧性肺动脉高压大鼠肺组织硫化氢的变化
本文旨在探讨低氧对大鼠内源性硫化氢体系的变化.采用生化反应方法测定血浆中硫化氢的含量和肺组织中硫化氢合酶的活性,采用定量竞争性RT-PCR的方法检测肺组织中胱硫醚-γ-裂解酶(CSE) mRNA的含量.结果显示,与对照组相比,低氧组大鼠的血浆硫化氢含量明显减少[(192.2±22.1)μmol/L vs (301.6±32.4)μmol/L, P＜0.01)],肺组织中硫化氢合酶的活性明显下降[(0.127±0.023) vs (0.278±0.099 )nmol/mg wet tissue·min, P＜0.01], CSE mRNA的含量明显减少[(1.02±0.15)×10-6 fmol vs (2.17±0.22)×10-6fmol, P＜0.01].以上研究表明,低氧对大鼠的内源性硫化氢体系有抑制作用.
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PCR定点诱变方法构建BCR-ABL cDNA竞争性PCR内参照物
本实验通过合成与原有下游引物(B)相似的一条新引物(B'),经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出比原BCR-ABL cDNA序列减少了4个碱基的参照物,达到定点诱变的目的.经酶切分析证明,两型BCR-ABL mRNA均可通过此方法得到相应的cDNA参照物.参照物和待测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离,证明了其可行性.该参照物可用于慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因的竞争性PCR,对此基因进行定量检测.
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NO前体对高肺血流时肺动脉胱硫醚-γ-裂解酶基因表达的调节作用
目的:研究一氧化氮(NO)前体L-精氨酸(L-Arg)对高肺血流时肺动脉胱硫醚-γ-裂解酶(内源性硫化氢生成酶)的调节作用,以探讨NO体系对高肺血流肺动脉高压及肺血管结构重建调节作用的机制.方法:30只雄性SD大鼠随机分为对照组,分流组和分流+L-Arg组.对后两组大鼠行腹主动脉-下腔静脉分流术.观察术后11周大鼠肺动脉平均压(mPAP)、右心室肥厚和肺动脉相对中膜面积的改变,用竞争逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对肺组织CSEmRNA表达进行定量分析,同时用化学法测定肺组织硫化氢产出率.结果:分流组大鼠mPAP及肺动脉相对中膜面积明显高于对照组(P＜0.01),而分流+L-Arg组大鼠mPAP及肺动脉相对中膜面积明显低于分流组(P＜0.01).分流组CSEmRNA表达与对照组相比明显降低(P＜0.01),而分流组+L-Arg组CSEmRNA表达又明显高于分流组(P＜0.05);分流组大鼠肺组织硫化氢产出率明显低于对照组(P＜0.01),而分流组+L-Arg组大鼠肺组织硫化氢产出率及血浆硫化氢含量明显高于分流组(P＜0.01).结论:高肺血流可致肺动脉CSEmRNA下调,外源性NO能够缓解CSEmRNA的改变,从而对高肺血流所致肺血管结构重建和肺动脉高压起调节作用.
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PCR在HBV核酸定量检测中的应用
目的:探索一种简便定量分析系统,通过检测HBV携带者血清中的HBVX区DNA,fRNA和trRNA拷贝数,为提高隐匿性感染期低复制状态HBV检测效果提供可能.方法:从血清中提取HBV DNA和RNA,对Core区、X区DNA进行PCR扩增,使用半巢式PCR法对fRNA 、trRNA在同一离心管中进行反转录并扩增,选取大小相近的质粒作为竞争模板对其进行定量.并对拉米夫定干预治疗14周前后的患者血清中HBV XDNA、Core DNA、fRNA和trRNA拷贝数进行检测与比较.所有检测结果均通过southern杂交进行验证.结果:建立了针对DNA的定量分析系统及针对RNA的RT-PCR定量分析系统,并且阐明了阿米夫定治疗前后HBV DNA和X区RNA结构和数量的变化.治疗前治疗后DNA和RNA的拷贝数均下降.Core DNA下降显著,为103-104倍,而XDNA拷贝数下降102倍.而fRNA和trRNA仅有小幅下降,为10倍左右.结论:可以通过竞争性PCR方法对血清中HBV DNA和RNA进行定量检测,以期为HBV病毒的诊断提供更充足依据.
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促卵泡刺激素受体mRNA的稳定性研究
采用核酸酶保护测定(NPA)和定量反转录竞争性多聚酶链反应方法(RT-PCR),测定了表达重组促卵泡刺激素受体(FSHR)的转染细胞 (Y1)的FSHR mRNA的稳定性和半衰期.对照组FSHR mRNA量在8 h内保持恒定水平[NPA,(2 .9±0.3) pg/μg RNA; RT-PCR,(2.7±0.3) pg/μg RNA].用[3H]尿苷结合到RNA的方法,观察到Actinomycin D (ActD,5 μg/ml) 在1 h内可抑制mRNA合成达90%. 在ActD存在的条件下,FSHR mRNA量在1 h后出现一个时间依赖性的显著下降,用NPA测得的半衰期为(3.6±0.2) h,RT-PCR为(3.1±0.1) h.提示mRNA的降解速率在FSH R基因稳定表达维持上起着非常重要的作用.
