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PCR定点诱变方法构建BCR-ABL cDNA竞争性PCR内参照物
本实验通过合成与原有下游引物(B)相似的一条新引物(B'),经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出比原BCR-ABL cDNA序列减少了4个碱基的参照物,达到定点诱变的目的.经酶切分析证明,两型BCR-ABL mRNA均可通过此方法得到相应的cDNA参照物.参照物和待测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离,证明了其可行性.该参照物可用于慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因的竞争性PCR,对此基因进行定量检测.
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bcr-abl基因检测寡核苷酸芯片的制备及分析
为了研究bcr-abl融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值,设计了融合基因检测探针,制成寡核苷酸芯片;采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA并进行杂交,以检测白血病细胞中bcr-abl基因.结果表明:通过对不同杂交温度、洗涤条件等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测出了细胞株中的bcr-abl融合基因.结论:应用寡核苷酸芯片检测白血病细胞bcr-abl融合基因有独特的优势,具有一定的临床应用价值,但也存在一定的不足,若对芯片进一步改进,则今后在血液病方面应用前景是非常广阔的.
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桂皮醛体外诱导慢性髓系白血病细胞凋亡的机理研究
本研究探讨桂皮醛(cinnamic aldehyde,CA)对慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞的诱导凋亡作用及其机制.以不同浓度的桂皮醛作用于体外培养的K562细胞和骨髓CML原代细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,Real-time PCR技术检测K562细胞BCR-ABL融合基因表达变化,免疫印迹法检测K562细胞CrkL磷酸化水平和C-MYC蛋白表达.结果表明:桂皮醛可诱导K562和骨髓CML原代细胞凋亡.在K562细胞凋亡过程中,BCR-ABL融合基因mRNA的表达、CrkL蛋白磷酸化及C-MYC蛋白表达均明显受抑.结论:桂皮醛体外诱导CML细胞凋亡,其机制与BCR-ABL融合基因表达和功能受抑有关.
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mdr1及bcr-abl阳性白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂STI571耐药的逆转
为了探索bcr-abl和mdr1阳性的白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂ST1571是否有交叉耐药及其逆转方法,采用MTT法检测ST1571对K562-n/VCR细胞的抑制作用,采用多药耐药逆转剂环孢菌素A(CsA)、他莫西芬(TAM)、α-干扰素(IFN-α)单用及CsA与IFN-α联合应用研究对ST1571耐药的逆转作用.结果表明:K562-n/VCR细胞对STI571有交叉耐药性.CsA,IFN-a,TAM 3种逆转剂对其均有不同程度的逆转作用,逆转倍数分别为5.18倍、1.67倍及1.82倍.而半量CsA+IFN-α对K562-n/VCR细胞STI571的逆转倍数为34.87倍.结论:多药耐药基因mdrl的扩增可以导致bcr-abl阳性白血病细胞对STI571的耐药.多药耐药逆转剂CsA,TAM和IFN-α对STI571耐药有明显的逆转作用,CsA与IFN-α半量联合对K562-n/VCR细胞的杀伤作用显著超过全量CsA或IFN-α的逆转耐药作用.本研究结果提示对STI571发生耐药的患者加用CsA和IFN-a,可能会提高其疗效.
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酪氨酸激酶抑制剂逆转K562/A02细胞多药耐药的研究
本研究旨在比较酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Imatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用.用RT-PCR法检测各组mdr-1 mRNA、bcr-abl mRNA表达;用Western blot法检测各组P-gp、P210蛋白表达;用流式细胞术检测各组细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积.结果表明:0.0625 μmol/L伊马替尼、5 nmol/L尼洛替尼对K562/A02细胞无明显细胞毒性,伊马替尼和尼洛替尼上述剂量单独作用48小时均下调mdr-1 mRNA、bcr-abl mRNA、P-gp、P210蛋白的表达,且尼洛替尼较伊马替尼作用更强.荧光强度检测显示,K562/A02细胞经伊马替尼、尼洛替尼单独处理48小时后,其细胞内DNR浓度分别为K562细胞中的7.85%、12.02%.结论:酪氨酸激酶抑制剂具有很好的逆转细胞耐药作用,且尼洛替尼较伊马替尼逆转作用更强.
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bcr-abl和白介素-7共表达基因疫苗诱导小鼠免疫保护作用
目的 探讨小鼠白介素-7(IL-7)基因对bcr-abl融合基因疫苗诱导机体免疫应答的影响.方法 采用pVbcr-abl/mIL-7质粒免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清中bcr-abl特异性抗体水平.以转染bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞为靶细胞,用LDH释放实验检测免疫小鼠脾细胞特异性细胞毒活性.结果 pVbcr-abl/mIL-7质粒能诱导小鼠产生血清特异性抗bcr-abl抗体,pVbcr-abl/mIL-7免疫组的血清特异性抗体滴度高于pVbcr-abl免疫组,脾细胞杀伤SP2/0/bcr-abl靶细胞的细胞毒活性明显增强.结论 共表达bcr-abl和mIL-7的基因疫苗能在小鼠体内诱导较高的特异性体液免疫和细胞免疫水平,为慢性粒细胞白血病基因疫苗的临床前实验研究提供了依据.
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多单位核酶对慢性粒细胞白血病细胞的增殖抑制及凋亡诱导效应研究
目的探讨多单位核酶体外净化慢性粒细胞白血病(慢粒)骨髓的可能性,研究多单位核酶的体外切割活性及对慢粒细胞恶性表型的逆转作用.方法针对慢粒发病中起重要作用的bcr-abl融合基因,在融合位点两侧44碱基范围内设计、合成3个核酶,其中2个切割位点位于bcr基因,1个位于abl基因.通过基因重组构建多单位核酶体外转录载体及逆转录病毒表达载体,鉴定其体外切割活性.将多单位核酶逆转录病毒表达载体转染K562细胞,应用MTT、3H-TdR掺入、RT-PCR、斑点杂交、流式细胞仪、透射及扫描电镜等方法,检测多单位核酶对慢粒细胞增殖活性及细胞超微结构、细胞周期、凋亡等的影响.结果多单位核酶的体外切割活性为70.8%,逆转录病毒载体转染慢粒K562细胞系后,细胞DNA合成及细胞增殖受到明显抑制,转染后96 h抑制率达50%左右.多单位核酶转染细胞后能够有效切割细胞RNA,使转染细胞RNA减少1 000倍左右.流式细胞仪检测显示多单位核酶转染72 h后,18.4%的细胞发生凋亡,大多数细胞被阻滞于G期,分裂期(S期)细胞数减少约41.9%.透射、扫描电镜见转染细胞出现核固缩、凋亡小体等细胞凋亡的特异性表现. 结论多单位核酶不仅具有较高的体外切割活性,而且其逆转录病毒载体能够有效转染慢粒细胞系,在细胞内持续表达、切割细胞RNA,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,逆转慢粒细胞的恶性表型,在慢粒基因治疗中具有潜在应用价值.
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伊马替尼治疗慢性髓系白血病的血药浓度研究进展
伊马替尼通过选择性地抑制bcr-abl融合蛋白的高酪氨酸激酶活性,成为第一个瞄准慢性髓系白血病(CML)致病原因的小分子靶向药物[1-2].新伊马替尼国际随机研究(IRIS)[3]显示伊马替尼应用于CML慢性期患者,8年总体生存率已达到85％,无事件生存率达81％.然而仍有15％ ～25％的患者发生伊马替尼原发或继发耐药[4-5].引起伊马替尼耐药的机制主要包括伊马替尼血药浓度的差异,bcr-abl基因的突变、扩增,肿瘤细胞的药物转运和外排系统,肿瘤细胞信号传导途径的异常,以及干细胞的休眠等[6].近年来,伊马替尼血药浓度对其临床疗效的指导意义越来越受到关注,我们就伊马替尼血药浓度的研究进展进行综述.
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ID4基因的研究进展
癌基因的活化(如ras基因、bcr-abl基因)或/和抑癌基因的失活(如P53基因、Rb基因)与肿瘤的发生密切相关.ID4基因是1994年Riechmann等首次从小鼠中分离鉴定的,发现该基因在胚胎发育的9.5d -13.5d是上调的,且在成人的脑、睾丸和肾脏器官高表达[1].在1995年,人的ID4基因被成功定位在染色体6p21.3-p22,同时发现通过增强ID4蛋白的表达可以抑制肌酸激酶E-box增强子的活化作用.ID4在不同肿瘤和同一肿瘤的不同阶段可能具有不同的作用,本文对ID4基因的研究现状做一小结.
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人慢性粒细胞白血病bcr-abl基因反义寡核苷酸对K562细胞株的凋亡诱导作用研究
背景与目的：随着人类基因组计划的完成，人们的研究重点已转向基因功能的研究，反义核酸技术无疑为这项宏伟工程提供了一个新的发展方向。目前，国内关于反义寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的实验研究很少。本实验在体外构建针对人慢性粒细胞白血病(chronic myelogenou leukemia，CML)bcr-abl融合基因mRNA的反义寡核苷酸，探讨bcr-abl反义寡核苷酸对K562细胞凋亡的诱导作用。方法：以bcr-abl融合基因mRNA翻译起始点融合前区19个寡核苷酸为作用靶点，设计反义寡核苷酸，以其反义寡核苷酸序列转染人慢性粒细胞K562细胞，采用Hoechst染色法观察不同浓度寡核苷酸对K562细胞株的凋亡情况，采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测自噬凋亡蛋白LC3-Ⅱ的表达情况，采用流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞周期变化，采用JEM-4000EX电镜术检测细胞凋亡形态变化，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡情况。结果：Hoechst染色结果显示，bcr-abl反义寡核苷酸能显著促进K562细胞的凋亡，且呈现一定的浓度依赖性。Western blot检测结果显示，bcr-abl反义寡核苷酸各浓度组凋亡自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示，bcr-abl反义寡核苷酸作用于K562细胞后，细胞周期阻滞于G0/G1期。各组G0/G1期、S期细胞数量与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。在JEM-4000EX电镜下可见明显的新月型凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳显示，10、30μmol/mL bcr-abl反义寡核苷酸组可以明显观察到以180~200 bp碱基对整倍数出现明暗间隔的DNA梯状条带。结论：Bcr-abl反义寡核苷酸可显著诱导K562细胞凋亡，为临床上基因治疗人CML提供一定的参考。
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BCR-ABL基因应用研究的进展
BCR-ABL基因在白血病中的发病机理已渐为人们所熟知.近年来,随着检测技术的日趋成熟,BCR-ABL基因检测在自血病MRD、移植物净化以及干细胞移植术中的作用愈来愈受到人们的重视和应用.本文对BCR-ABL近年来的一些应用研究作一综述.
