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重组腺病毒AdE-SH2-Caspase 8对耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响
目的:研究表达融合蛋白SH2-Caspase 8的重组腺病毒AdE-SH2-Caspase 8-HA-GFP(SC)对BCR/ABL阳性的耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响.方法:K562/G01细胞经重组的腺病毒SC感染后,分别设突变AdE-SH2m-Caspase 8-HA-GFP(SmC)组、病毒空载AdEGFP(CMV)组和PBS对照组.荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测病毒感染效率,Western blot检测融合蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达水平,光学显微镜观察经瑞氏染色后的细胞形态,FCM和DNA梯度电泳检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3和PARP的表达水平.结果:重组腺病毒在K562/G01细胞中的感染效率较高;Western blot能检测到目的蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达;与对照组比较,瑞氏染色后SC组出现明显的凋亡形态改变,FCM检测结果表明SC组早前凋亡细胞明显增高(P＜0.05),DNA梯度电泳检测结果发现SC组出现明显细胞凋亡特异性的梯度条带,Western blot结果表明SC组凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP活化片段的表达水平升高.结论:重组腺病毒SC表达的SH2-Caspase 8融合蛋白能明显诱导K562/G01细胞的凋亡.
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BCR-ABL融合基因检测方法的进展
BCR-ABL融合基因可编码产生BCR-ABL融合蛋白,是慢性粒细胞白血病的特征性标志,对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗具有重要意义.目前临床有多种方法可对其进行检测,主要有细胞遗传学、荧光原位杂交、聚合酶链式反应、Western Blot印迹法、流式免疫磁珠(CBA)等检测方法.这些检测方法有的费时费力,有的需要专门的实验设备等,故在临床应用中受限.随着对BCR-ABL融合基因检测技术的发展,CBA法对BCR-ABL融合蛋白的检测具有其特有的优越性而得到越来越多的应用.
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异硫氰酸苯己酯对K562/G01细胞伊马替尼耐药性的影响
目的 体外观察异硫氰酸苯己酯(PHI)对人慢性髓性白血病细胞株K562/G01细胞伊马替尼耐药性的影响,探讨其可能的机制.方法 采用MTT法检测不同浓度的PHI和伊马替尼单独或联合处理对K562/G01细胞增殖的抑制作用.流式细胞术检测不同浓度的PHI和(或)伊马替尼作用下K562/G01细胞的凋亡率.Western blot检测PHI处理K562/G01细胞后P-gp、P210bcr-abl蛋白、磷酸化P210bcr-abl蛋白(p-P210bcr-abl)表达水平的变化.结果 PHI单独处理24 h可抑制K562/G01细胞增殖,诱导细胞凋亡.PHI浓度由0增至40 μmol/L,细胞增殖抑制率由0增至(51.22±1.41)%,凋亡率由(3.76±1.46)%增至(35.35±3.70)%.浓度分别为10、20、40 μmol/L的PHI与不同浓度伊马替尼联合处理后,伊马替尼的IC50分别为(10.49±1.24)、(6.33±1.42)、(0.85±0.17)μmol/L.PHI 20 μmol/L和浓度为10、20 μmol/L的伊马替尼分别共同作用24 h后,K562/G01细胞凋亡率分别为(43.62±4.23)%和(55.41±4.35)%,较单用伊马替尼组及单用PHI组均明显升高.PHI浓度由0增至40 μmol/L分别作用7 h后,K562/G01细胞P210bcr-abl/β-actin比值由0.944±0.034降至0.392±0.025,p-P210bcr-abl/β-actin比值由0.906±0.019降至0.361±0.021,但P-gp表达无明显变化.结论 PHI能抑制K562/G01细胞增殖,诱导细胞凋亡.PHI与伊马替尼联合有协同作用,可部分逆转细胞对伊马替尼的耐药,其机制可能与抑制P210bcr-abl和p-P210bcr-abl蛋白表达有关.
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腺病毒介导的SD-HA对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用机制
目的 探讨融合蛋白SD-HA能否通过竞争结合BCR-ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点(Y177p),调控与其相关的下游信号分子活性,进而抑制K562细胞增殖并诱导凋亡.方法 Western blot结合免疫共沉淀技术分析融合蛋白SD-HA与BCR-ABL的Y177p的相互作用,及其对下游信号途径Ras-MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt的影响;Western blot分析融合蛋白SD-HA对细胞膜受体死亡途径级联反应caspase-8、caspase-3和PRAP的影响.结果 双向免疫共沉淀实验可检测到融合蛋白SD-HA能与Grb2竞争性结合BCR-ABL Y177p,形成复合物.融合蛋白SD-HA可降低活化Ras、磷酸化MAPK(p-MAPK)、p-ELK的表达水平,抑制Ras-MAPK信号途径;融合蛋白SD-HA还可降低p-Akt及Akt的底物p-GSK的表达水平,抑制PI3K-Akt信号途径,从而抑制K562细胞增殖;通过死亡效应结构域(DED)与caspases-8前体DED结合而寡聚化,激活caspases-8、caspase-3和PRAP,诱导K562细胞凋亡.结论 融合蛋白SD-HA抑制BCR-ABL-Y177与Grb2结合的策略,可作为慢性髓性白血病治疗新的切入点.
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三氧化二砷诱导T315I突变细胞KBM5R凋亡机制研究
伊马替尼( Imatinib,IM)是以bcr-abl融合蛋白为作用靶点的治疗慢性髓系白血病(CML)有效的酪氨酸激酶抑制剂(TKI),但长期应用可使部分CML患者产生IM耐药性[1],特别是bcr-abl基因T315I点突变的CML患者对第一代和第二代TKI均具有较强的耐药性[2].我们前期临床试验已经证明,三氧化二砷( ATO)对T315I突变的KBM5细胞(KBM5R)增殖具有明显的抑制作用,可导致细胞G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡,并且ATO对KB M5R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显强于野生型KBM5细胞[3-4].我们通过检测ATO对KBM5、KBM5R细胞bcr-abl mRNA和蛋白水平的变化及其对下游相关信号传导途径PI3K-AKT、JAK-STAT5的影响,探讨ATO对T315I突变KBM5R细胞诱导凋亡的作用机制.
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塞来昔布对K562细胞BCR-ABL融合蛋白及下游增殖信号转导途径的影响
慢性粒细胞白血病(CML)具有特征性的染色体易位t(9;22)(q34;q11),产生bcr-abl融合基因,编码BCR-ABL融合蛋白(P210),后者通过持续激活蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性,并激活JAK-STATS等信号转导途径,导致细胞增殖调节失控.
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伊马替尼治疗慢性髓系白血病的血药浓度研究进展
伊马替尼通过选择性地抑制bcr-abl融合蛋白的高酪氨酸激酶活性,成为第一个瞄准慢性髓系白血病(CML)致病原因的小分子靶向药物[1-2].新伊马替尼国际随机研究(IRIS)[3]显示伊马替尼应用于CML慢性期患者,8年总体生存率已达到85％,无事件生存率达81％.然而仍有15％ ～25％的患者发生伊马替尼原发或继发耐药[4-5].引起伊马替尼耐药的机制主要包括伊马替尼血药浓度的差异,bcr-abl基因的突变、扩增,肿瘤细胞的药物转运和外排系统,肿瘤细胞信号传导途径的异常,以及干细胞的休眠等[6].近年来,伊马替尼血药浓度对其临床疗效的指导意义越来越受到关注,我们就伊马替尼血药浓度的研究进展进行综述.
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泛素连接酶β-TrCP降解BOR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的抑制
目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用.本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization doraain,OD)特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP的β-TrCP-OD-HA的重组腺病毒载体,经泛素-蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的影响.方法:HEK293细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5AF-TrCP-OD-HA及空载Ad5GFP重组腺病毒栽体,感染K562细胞.以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA对K562细胞增殖的影响.结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA重组腺病毒载体的K562细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4%以上,β-TrCP-OD-HA、AF-TrCP-OD-HA可在K562细胞中表达.三组重组腺病毒载体感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S期细胞数下降至10.88%±2.42%、G_0/G_1期升高至85.6%±5.61%,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P均<0.05).结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、△F-TrCP-OD-HA能够在白血痛K562细胞中表达;β-TrCP-OD-HA可以抑制K562细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现.
关键词： BCR-ABL融合蛋白 泛素连接酶β-TrCP K562细胞 细胞增殖 -
流式免疫磁珠法检测BCR-ABL融合蛋白在白血病中的意义
目的:探讨流式免疫磁珠(CBA)法检测白血病患者BCR-ABL融合蛋白的方法学评价及其意义.方法:采用CBA法检测64例白血病患者和10例正常人外周血白细胞中BCR-ABL融合蛋白表达,同时与实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和荧光原位杂交(FISH)法比较.结果:正常人外周血白细胞BCR-ABL融合蛋白平均荧光强度(MFI)是10.58±3.88,64例白血病患者中BCR-ABL阳性25例,仅1例B-ALL患者检测结果与RQ-PCR结果不一致,与FISH检测结果完全一致.结论:CBA法检测BCR-ABL融合蛋白方法可靠,重复性好,简单,快速,具有良好的临床应用前景.
关键词： BCR-ABL融合蛋白 白血病 细胞微球阵列 流式免疫磁珠法 -
一种海洋来源的ETP类化合物HDN-1诱导K562细胞凋亡作用及机制初探
目的 探讨南极土壤来源真菌的次级代谢产物HDN-1对人慢性粒细胞白血病K562细胞的增殖抑制,诱导凋亡作用及其机制.方法 采用MTT法检测HDN-1对K562细胞的增殖抑制作用;DNA结合染料Hoechst 33342染色,Western Blotting以及DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的变化.结果 HDN-1能显著抑制K562细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性;HDN-1作用后,细胞核形态发生明显变化并且出现了基因组DNA的梯状剪切条带;Caspase-9、8、3逐渐被激活,Caspase3的作用底物PARP被活化裂解出现89 kD的剪切条带,并且Caspase蛋白的激活可被特异性抑制剂所阻断;抑凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1的表达降低,促凋亡蛋白Bax的表达量增高.另外,融合蛋白Bcr-Abl的表达被HDN-1抑制并呈剂量依赖性.结论 来源于南极土壤来源真菌的次级代谢产物HDN-1可能是通过抑制Bcr-Abl融合蛋白的表达进而诱导K562细胞凋亡,并且凋亡是通过Caspase依赖的线粒体途径和死亡受体途径共同介导发生的.
关键词： K562细胞 HDN-1 BCR-ABL融合蛋白 细胞凋亡 -
SEA联合K562细胞体外诱导正常人脐带血单核细胞TCRζ链表达的作用
目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞体外诱导脐血T细胞活化TCRζ链基因表达情况.方法:常规分离4例脐带血单核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体、单纯K562细胞、SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导T细胞活化增殖,并设空白对照组.刺激培养48 h后收集各组细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR Green I荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-计算TCRζ链表达差异倍数.结果:抗CD3单抗组、K562细胞组、SEA组、SEA联合 K56 2细胞组诱导培养T细胞中.TCRζ链表达差异倍数分别是(4.52±0.96)、(1.65±0.26)、(1.43±0.44)、(3.41±0.30),表明各组均有活化T细胞的作用,但各组TCRζ链表达水平有差异,其中SEA联合 k562 细胞组的T细胞f链基因表达均明显高于单纯k562组及单纯SEA组(P<0.01).结论:超抗原SEA有助于增强 K562 细胞体外诱导T细胞活化作用.
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BCR-ABL SH3双位点突变体构建及其促进KCL22细胞凋亡的研究
目的：BCR-ABL SH3结构域双位点突变体构建，探讨其促进CML细胞株凋亡机制，为CML治疗奠定基础。方法：采用重叠延伸PCR 扩增双突变体，构建含ABL SH3双突变基因的重组腺病毒载体，流式细胞术分析突变体对KCL22细胞凋亡的影响；同源建模构建ABL SH3双突变体；PepSite2．0软件预测双突变体相关蛋白结合能力。应用SPSS 16．0软件进行统计分析。结果：成功构建双突变体重组腺病毒载体，流式细胞术显示突变体较野生型显著促进 KCL22细胞凋亡；成功模拟并获得稳定的双突变体三维结构，筛选出的突变体与相关蛋白结合能力较野生型大大提高。结论：双突变体显著促进KCL22细胞凋亡，为ABL SH3结构研究及CML的治疗提供了理论基础。
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格列卫治疗进展期慢性粒细胞白血病的临床疗效观察
甲磺酸伊马替尼(商品名;Glivec,格列卫,国际通用名为imatinib mesylate,临床研究代号:ST1571)是一种2-苯嘧啶衍生物,它通过取代BCR-ABL融合蛋白中的ATP而阻断ABL酪氨酸激酶的持续磷酸化,从而抑制Ph阳性白血病克隆的增殖和抗凋亡作用,成为第一个成功治疗Ph阳性慢性粒细胞白血病(CML)的靶向药物[1].近年来国外对格列卫有大量的临床研究.国内对于格列卫治疗进展期(即加速期、急变期)慢性粒细胞白血病的临床报道并不多.本研究回顾了于2003年9月至2009年6月在新疆医科大学血液科确诊并接受伊马替尼治疗的18例进展期CML患者和接受联合化疗的21例进展期CML患者的临床资料,经过比较两组病人的疗效,来探讨格列卫对进展期CML的临床疗效.
