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Embelin逆转K562/D细胞对柔红霉素耐药与P-gp及MDR1mRNA无关
目的:探讨XIAP抑制剂Embelin逆转K562/D细胞对柔红霉素(daunorubicin,DNR)耐药的机制以及与P-gp及MDR1 mRNA的关系.方法:应用MTT法检测不同浓度DNR及联合Embelin对K562及K562/D细胞增殖抑制情况的影响;应用Annexin V-FITC/PI复染流式细胞术检测细胞凋亡的改变;用Western blot方法检测XIAP、Caspase-3、P-gp、BCL-2及BAX的蛋白表达情况;用RT-PCR检测XIAP、MDR1、BCL-2及BAX的mRNA表达情况.结果:DNR作用于K562与K562/D细胞系24 h的IC50值分别为2.177 μg/ml和69.43μg/ml,耐药指数为31.89;分别用浓度为3、10、30、100及300 μg/ml的Embelin作用于K562/D细胞系24 h,其增殖抑制率分别为2.70％±1.08％、10.92％±4.89％、28.13％±2.09％、36.56％±3.24％及43.59％±1.16％;用0.1、1、10及100μg/ml DNR联合10 μg/ml Embelin作用于K562/D细胞系24 h,细胞增殖抑制率分别为31.92％±3.29％、49.57％±6.87％、55.16％±0.78％和71.94％±3.89％,其IC50值为2.11 μg/ml,逆转指数为32.91.用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡率.单独应用0.1 μg/ml DNR作用于K562/D细胞系24 h的细胞凋亡率为12.06％±0.95％,而联合10和30 μg/ml Embelin作用于K562/D细胞系24h的细胞凋亡率分别为27.54％±0.59％和39.59％±1.57％;Western Blot结果显示,DNR联合Embelin后,Caspase-3的表达明显下降(P＜0.05),且用抑制剂Z-VAD-FMK可以抵消药物联合应用对细胞的增殖抑制作用.同时,XIAP和BCL-2蛋白表达明显下降(P＜0.05),BAX蛋白表达明显升高(P＜0.05),而P-gp的表达无改变;RT-PCR结果显示,DNR联合Embelin后,XIAP和BCL-2 mRNA表达明显下调(P＜0.05),BAX mRNA表达明显上调(P＜0.05),MDR1 mRNA表达无明显变化(P＞0.05).结论:降低XIAP表达有助于增强DNR对K562/D细胞的作用;Embelin逆转K562/D细胞对DNR耐药机制与P-gp及MDR1 mRNA无关.
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ATP-TCA药敏试验测定的胃癌耐药性与MDR1 mRNA和P-gp表达的关系
目的 评价三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验(ATP-TCA)测定的原发性胃癌耐药性与耐药基因以及蛋白表达的关系.方法 选择2009-2011年间收治的胃癌患者52例,采用ATP-TCA检测胃癌患者对5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶+阿霉素+丝裂霉素、奥沙利铂+20倍5-氟尿嘧啶5种方案的体外药物敏感性,采用逆转录PCR以及荧光定量PCR检测胃癌患者组织中耐药基因MDR1的表达,采用流式细胞仪检测胃癌患者血中p-糖蛋白(P-gp)表达,采用,检验分析ATP-TCA检测结果与MDR1和P-gp表达之间的相关性.结果 ①5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶+阿霉素+丝裂霉素、奥沙利铂+20倍5-氟尿嘧啶5种方案与临床疗效明显相关(P＜0.01),其中奥沙利铂+20倍5-氟尿嘧啶方案的ATP-TCA检测结果与临床疗效的符合率高,达84.6％(44/52).②ATP-TCA检测化疗敏感和耐药患者MDR1 mRNA的表达水平分别为(0.673±0.143)和(1.436±0.594),两者比较差异有统计学意义(P=0.008).③用流式细胞仪检测52例胃癌患者P-gp表达量,其中阳性20例,阳性率达38.4％,P-gp的表达与ATP-TCA药敏试验有明显相关(P＜0.01).结论 ATP-TCA检测耐药结果与MDR1 mRNA和P-gp表达之间存在明显的相关性,临床检测MDR1 mRNA和P-gp表达可有效预测临床化疗敏感性,指导胃癌的个体化治疗.
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端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对乳腺癌细胞生物学特性及干细胞富集的影响
目的：探讨人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸（hTERT ASODN）对乳腺癌MCF-7细胞系干细胞微球体富集及其生物学特性的影响。方法以人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸，脂质体介导转染，以正义序列转染作为对照。实验分设转染组（ASODN组），正义序列转染的对照组（SODN组）及空白对照组。采用无血清悬浮培养法观察转染对MCF-7干细胞微球体富集的影响。Western blot检测各组干性标记物CD44及ALDH1的表达。RT-PCR检测各组ABCG2、MDR1 mRNA的表达。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学处理。结果 ASODN组干细胞微球体生长速率及球体体积明显差于两对照组。与空白对照及SODN组比较，Western blot 检测发现CD44与ALDH1在ASODN组细胞表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。RT-PCR 检测发现，在ASODN组细胞ABCG2及MDR1 mRNA的表达量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。而空白对照组及SODN组两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 hTERT ASODN在抑制乳腺癌干细胞微球体的富集、降低乳腺癌细胞干性表达及其耐药性方面具有重要作用。
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多药耐药基因作用的新发现
目的:观察被照射的小细胞肺癌细胞系在外照射前后其总RNA(核糖核酸)、MDR1 mRNA(多药耐药基因的信使核糖核酸)、药物敏感性和放射敏感性的变化,从而探讨多药耐药基因是否还有其他未被揭示的新作用.方法:采用GWGP80型远距离60Co治疗机对进入指数生长期的NCI-H446小细胞肺癌细胞系进行分次外照射.用Trizol分别提取未照射细胞(S-cell,Sc)和已完成全部外照射剂量的NCI-H446细胞(R-cell,Rc)的总RNA.采用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法来确定两组细胞MDR1 mRNA表达的高低.通过加入丝裂霉素和逆转剂维拉帕米后的干扰来分别观察外照射前后NCI-H446细胞系存活率的变化.然后对Sc和Rc再给予不同剂量的外照射,1周后计算它们各自的集落形成率(PE)和存活率(S).结果:在相同细胞数和相同体积的条件下,未照射组和照射组细胞总RNA的浓度分别为25.9 mg/L和16.6 mg/L;未照射组细胞其MDR1 cDNA(多药耐药基因的逆转录脱氧核糖核酸)/β-actin cDNA为1.078,照射组为1.338.在相同浓度的化疗药丝裂霉素的干扰下,照射组细胞的存活率均明显高于未照射组(P<0.01);再加入逆转剂维拉帕米后,两组细胞的存活率则变化不大(P>0.05).在分别给予2 Gy和4 Gy的外照射后,照射组细胞的存活率(S)分别为(79.67±34.48)%和(23.73±8.62)%,而未照射组的分别为(51.24±11.88)%和(19.40±5.59)%,其差异有统计学意义(P<0.05).结论:化疗药以外的损伤因素也可以使多药耐药基因表达增强,而这些损伤因素所引起的多药耐药基因的高表达均可以使细胞对后来的其他损伤因素产生耐受.因此,多药耐药基因应改称耐多种损伤基因似乎更能体现其内涵.
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MDR1短发夹RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究
目的构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的表达质粒,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1 mRNA的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响.方法根据Genbank中MDR1 mRNA设计的两条多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌细胞株BEL-7402/ADM,RT-PCR分析MDR1 mRNA的表达,MTT法检测阿霉素对细胞的半数抑制浓度(IC50).结果PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制BEL-7402/ADM MDR1 mRNA的表达,对阿霉素的耐药指数降低了17.5倍(299.2/17.1).结论构建的pshRNA-MDR1表达质粒能有效地抑制转染细胞MDR1 mRNA,从而提高肿瘤细胞的药物敏感性.
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柚皮素对K562/A02细胞MDR1 mRNA/P-gp的影响及机制研究
目的:研究柚皮素对MDR1 mRNA与P-糖蛋白(P-gp)表达的影响及其分子生物学机制.方法:将不同浓度的柚皮素(50、100、250、500μmol/L)单独或联合阿霉素(5μmol/L)作用于K562/A02细胞48 h,RT-PCR法检测MDR1 mR-NA的表达水平,Western-blot法检测P-gp的表达水平,并以NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)为对照,比较柚皮素与PDTC间的差异.结果:系列浓度柚皮素作用于K562/A02细胞48 h后能显著抑制MDR1 mRNA(IC50=460.3μmol/L)及P-gp的表达(IC50=286.3 μmol/L),抑制作用随浓度的增加而增强;无毒剂量的柚皮素抑制强度与PDTC相近(P＞0.05);经阿霉素诱导后二者抑制效应仍然相仿(P＞0.05).结论:柚皮素明显抑制K562/A02细胞MDR1 mRNA及P-gp的表达,可能与PDTC的作用机制相同,即限制IκB-α磷酸化,阻抑NF-κB的活化,从而抑制MDR1的转录,导致MDR1 mRNA及P-gp的表达量下调,终使得药物外排转运效应下降.
关键词： 柚皮素 K562/A02细胞 MDR1 mRNA P-糖蛋白 NF-κB -
益气化痰方抗肺癌化疗多药耐药的作用
目的:分析益气化痰方抗肺癌化疗多药耐药的作用,通过检测肺癌患者外周血中MDR1 mRNA和CK20 mRNA的表达,从分子水平进一步阐明益气化痰方抗肿瘤细胞多药耐药的机制.方法:非小细胞肺癌患者200例随机平均分为观察组与对照组.观察组给予益气化痰方+化疗;对照组给予益肺清化颗粒+化疗.观察两组临床症状、瘤灶、生存质量、免疫指标、肿瘤标志物以及外周血中MDR1 mRNA和CK20 mRNA的表达.结果:观察组治疗前后外周血MDR1mRNA比较,差异无统计学意义(P＞0.05);对照组治疗后明显高于治疗前(P＜0.05);两组治疗后比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两组外周血CK20 mRNA水平在治疗后均有所下降(P＜0.05),但观察组下降更为明显,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两组患者治疗后症状积分均较治疗前明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);观察组治疗后症状积分低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).两组患者治疗后外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及NK细胞分布均高于治疗前,而CD8+细胞比例低于治疗前,差异均有统计学意义(P＜0.05);观察组以上指标改善优于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).观察组稳定率为86％,对照组为69％,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).治疗后,两组患者CEA、NSE、Cyfr21-1水平均下降,且观察组显著低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:益气化痰方可抑制化疗对MDR1 mRNA水平的升高作用,降低CK20 mRNA表达水平,对化疗有一定增效的作用;还可减轻患者临床症状,提高生存质量,提高肿瘤患者免疫功能.
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姜黄素对Caco-2细胞上P-糖蛋白活力及MDR1mRNA表达的影响
目的 研究姜黄素对Caco-2细胞上P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响,并从分子水平研究其对MDR1mRNA表达的影响.方法 采用流式细胞仪测定P-gp底物——罗丹明-123在细胞中的浓度,并分析Caco-2细胞上p-糖蛋白的表达量；采用RT-PCR法分析Caco-2细胞上MDR1基因mRNA的表达量.结果 低、中、高浓度(0.1、0.5、1.0 μmol·L-1)的姜黄素增加了罗丹明-123的外排,其外排量分别增加了6.2％、22.2％和33.8％(P＜0.05)；0.1～1.0 μmol·L-姜黄素与细胞孵育72 h后,细胞膜上的荧光强度随浓度增加而增强(P＜0.05),P-gp表达量是空白对照组的4倍,MDR1基因mRNA表达水平上调了1.58倍.结论 姜黄素并不是P-gp的抑制剂,它能在较低浓度以及较短时间内(1 h)增强Caco-2细胞上P-gp的功能活性,从而减少罗丹明-123在细胞内的蓄积.长时间(72 h)应用姜黄素可以诱导P-gp和MDR1 mRNA的表达.姜黄素将有可能引起相应的药物-药物/食物的相互作用.
