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急性髓系白血病中医证型与ID4基因启动子区甲基化相关性研究
目的 研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓细胞中ID4基因启动子区甲基化状态与中医证型的关系,探讨ID4基因甲基化与AML发生、发展的关系.方法 选取35例2010年2-12月山东中医药大学附属医院血液科住院或门诊AML患者作为试验组,另选取10名山东中医药大学附属医院健康体检中心体检健康者作为对照组,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MS-PCR)检测两组ID4基因启动子区甲基化状态并进行组间及中医证型间比较,分析中医证型与基因启动子区甲基化相关性.结果 AML患者ID4基因启动子区甲基化为27例(77.1％),与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).各证型患者ID4基因启动子区甲基化阳性率由低到高依次为气阴两虚证＜瘀血痰结证＜毒热炽盛证,差异均有统计学意义(P＜0.05).ID4基因启动子区甲基化阳性患者外周血白细胞数、骨髓原始细胞比例高于阴性患者,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 毒热炽盛证、瘀血痰结证患者更易出现ID4基因甲基化,ID4基因启动子区甲基化阳性表达从分子水平验证了AML初期中医邪实内存的本质,也一定程度上反映了AML恶性程度.
关键词： 急性髓系白血病 ID4基因 DNA甲基化 中医分型 甲基化特异性聚合酶链反应 -
ID4基因甲基化定量PCR检测在急性白血病中的临床意义
尽管治疗的进步极大地改善了急性白血病患者的预后和生存,但时至今日多数类型的急性白血病没有特异性的生物标记,因此对于多数白血病患者,影响生存的复发这一重要因素缺少有效的顸警机制.ID4基因启动子区甲基化广泛发生于各类型急性白血病.本研究在前期建立的甲基化定量PCR体系的基础上,用该方法检测患者骨髓样本,探讨ID4甲基化定量指标(percentage of methylated reference,PMR)的临床意义.采集我院门诊及住院确诊的初治、完全缓解、复发3个阶段的急性白血病患者骨髓样本及正常对照者骨髓样本.应用ID4甲基化定量PCR体系对样本进行检测.按初治、完全缓解、复发分组比较PMR值.比较相同病例不同疾病状态的PMR的动态变化.结果表明,初治组PMR高,其次为复发组,而完全缓解组低.初治组PMR与完全缓解组比较存在统计学差异.4例随访病例的PMR值波动与病情变化一致.在1例复发病例中,PMR升高早于骨髓细胞学检查确认复发1.7个月.结论:本研究通过ID4基因启动子区甲基定量检测的方法初步验证:甲基化水平的量化指标PMR值与急性白血病患者肿瘤细胞负荷关系密切.PMR动态监测波动与疾病变化一致,可能具有预测复发的作用,但ID4甲基化定量指标的临床价值还有待进一步研究证据的支持.
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急性白血病细胞中ID4基因甲基化的PCR定量检测系统的建立及其特异性和敏感性
ID4基因启动子区甲基化发生率在急性白血病中极高,甲基化程度与急性白血病关系密切.因缺少合适的研究方法,其具体的甲基化量化水平与疾病的关系,人们一直缺乏认识.本研究旨在建立ID4甲基化定量PCR体系,同时验证该方法的特异性及敏感性,并初步尝试在初治急性白血病骨髓样本中评估ID4的甲基化水平.首先构建质粒并建立体系标准曲线,分别使用MSP和定量MSP对细胞系样本进行检测,以传统MSP的结果为对照,验证新方法的特异性;按不同比例将甲基化阴性和阳性细胞混合,用甲基化定量PCR扩增验证新方法敏感性.结果表明,本研究成功建立了符合绝对定量要求的标准曲线;通过细胞系验证,MSP结果与定量MSP结果完全一致;同时在甲基化阴性细胞背景下,定量MSP可以稳定的检测到1∶10-5水平的1D4甲基化阳性细胞.在急性白血病骨髓样本检测中,定量MSP甲基化阳性检出率高于MSP.结论:本研究成功建立了完整的ID4基因甲基化定量PCR体系,该方法特异性好、敏感性高.
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Id4基因启动子甲基化在髓系白血病完全缓解期监测中的意义
本研究探讨id4基因甲基化在完全缓解急性髓系白血病(AML)病情监测中的意义.采用甲基化特异性PCR(MS.PCR)对经诱导缓解和巩固强化4-5疗程后持续完全缓解的AML患者进行id4基因启动子区甲基化状况分析,并随访.结果表明:id4基因在32例AML中有15例id4基因甲基化,其中7例在随访期间出现复发或复发倾向.17例id4基因非甲基化的患者在随访期间完全缓解.结论:在完全缓解的AML患者中进行id4基因启动子区甲基化检测可在一定程度上预测白血病的复发.
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急性髓系白血病ID4基因甲基化研究
本研究旨在探讨急性髓系白血病(AML)患者中ID4基因甲基化状态.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对46例不同亚型、不同病期的AML患者骨髓细胞进行ID4基因启动子区甲基化状况检测,并以10例缺铁性贫血患者骨髓作为对照.结果表明,ID4基因在对照组患者骨髓中呈完全性非甲基化状态,在46例AML患者中有39例患者出现ID4基因甲基化(阳性率为84.8%),其中各AML亚型M1、M2、M3、M4、M5、M6患者ID4基因甲基化阳性率分别为4/4、9/12、8/8、7/9、9/11、2/2.初治,完全缓解的AML患者ID4基因甲基化阳性率分别为27/30、7/11,另有5例复发难治患者均检测出ID4基因甲基化,与对照组相比,差异均有统计学意义(p＜0.01).结论:与对照组患者相比,AML不同亚型、不同病期患者ID4基因发生了不同程度的甲基化改变,这表明ID4基因甲基化可能是AML发生发展过程中的一个早期分子事件.
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急性白血病Id4基因启动子区甲基化状态研究
本研究探讨正常人和不同疾病状态急性白血病(AL)患者Id4基因启动子区甲基化状态差异.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对正常人和AL患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测.结果表明:Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态,初治AML和ALL患者中Id4基因甲基化比例分别为84%和86%.8例复发难治的AL患者中Id4基因全部甲基化,14例Id4基因甲基化的完全缓解ALL患者中有8例在12个月内复发,而9例Id4基因非甲基化的完全缓解ALL患者中12月内复发仅1例;Id4基因呈甲基化状态的完全缓解的AML患者中12个月内复发率为62.5%,而在非甲基化的患者中12个月内复发率仅为10%,两者差异有显著性意义.完全缓解的ALL患者甲基化比例为64.3%,而完全缓解的AML患者甲基化比例为28.6%,两者差异有显著性意义.39例初治AL中,有33例Id4基因呈甲基化状态,8例复发难治的AL患者的Id4基因均呈甲基化状态,58例完全缓解的AL中,有24例Id4基因呈甲基化状态.结论:与正常人不同,AL患者中Id4基因都发生了不同程度的甲基化改变,缓解状态患者的甲基化比例低于非缓解状态患者,Id4基因甲基化模式的改变与AL的发生密切相关.
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在不同类型骨髓增生异常综合征Id4基因甲基化差异的初步研究
本研究探讨Id4基因在不同类型骨髓增生异常综合症(MDS)患者中的甲基化情况差异.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对50例不同类型MDS患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测,并以缺铁性贫血患者骨髓作为对照.结果发现:Id4基因在对照组骨髓中呈完全非甲基化状态,在MDS各种类型中,甲基化状态有差异:6例RA、2例RARS和4例MDS-U患者骨髓Id4基因均呈非甲基化状态,而18例RCMD中有2例,12例RAEB Ⅰ和8例RAEBⅡ中各有3例为Id4基因甲基化.骨髓原始细胞比例分别低于和高于5%的两组患者中,Id4甲基化分别有2例和6例,各占每组的6.7%和30%,差异有显著性意义.初步结论是:骨髓原始细胞比例高的MDS患者有可能发现Id4基因甲基化.
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药物靶向调控ID4基因表达的生物信息学预测与分析
ID4基因低表达与肿瘤发生关系密切,其高表达具有明确的抗白血病作用,但在白血病细胞无表达.本研究初步通过生物信息学方法分析ID4基因启动子的结构,预测调控ID4基因表达的顺式元件及相关药物,为筛选有靶向调控ID4基因表达的药物创造前提.以人类基因组数据库和计算机互联网为平台,钓取ID4基因5'侧翼区3 000 bp非编码DNA序列和mRNA序列中的ORF序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件在人类转录因子数据库中搜索可能存在的顺式结构;利用SAGE和GEO数据库对影响ID4基因表达的相关因素进行分析.结果表明:ID4基因具有Ⅱ型启动子,在5'-非翻译区的-45 bp处有1个典型的TATA盒.在长度为1 300 bp的ID4启动子区,存在多个顺式结构,其中包括Spl、c-Myb、abaA、C/EBPalpha、GR、ERE和Zeste可能具有正向调控作用;CCAAT-binding factor、GCE、WTl-KTS、HiNF-C和EGR2可能具有负向调控作用.结论:ID4基因的表达可能受糖皮质激素、雌激素、甲状腺素和卵泡刺激素等多种活性物质的调控.
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人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建
本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制.方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5'侧翼区约2242 bp及下游5'非翻译区212 bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829 bp和784 bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnVEcom对获得的2个pCEMT重组载体及pGL3 Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性茼落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子;经Kpnl/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459 bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400 bp左右设计了5对3'端平齐、5'端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112 bp、1 703 bp、1 290 bp、784 bp和496 bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T栽体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT 重组载体及pet3 Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定.结论:成功克隆了长度为2.5 kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pCt3-Basic荧光素酶报道重组子.
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Id4基因甲基化在恶性淋巴瘤中的检测意义
本研究探讨id4基因启动子区甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中的检测意义.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对正常人和初诊NHL患者骨髓进行id4基因启动子区甲基化状况进行检测,同时进行骨髓穿刺和骨髓活检,并对患者进行随访.结果表明:id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态.18例初治NHL患者中1例经骨髓活检证实有淋巴瘤骨髓受累,4例发现有id4基因甲基化.14例id4基因非甲基化的NHL患者在8个月随访期内病情稳定,再次检测骨髓未发现淋巴瘤骨髓受累,而1例id4基因甲基化伴骨髓受累的NHL患者在随访期间转变为白血病,3例id4基因甲基化伴无骨髓受累的NHL患者中2例在随访期间复查发现有骨髓受累.结论:在骨髓检查正常的NHL患者中检出id4基因甲基化可能提示淋巴瘤骨髓微量受累.
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四种恶性血液病细胞系的Id4基因启动子甲基化
本研究探讨4种白血病和淋巴瘤细胞系以及非肿瘤细胞系和正常人骨髓Id4基因启动子甲基化状态及其差异.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对白血病细胞系K562和HL-60、淋巴瘤细胞系Ramous和CA46以及良性细胞系Hek937和正常人骨髓细胞进行Id4基因甲基化状态检测.结果表明:Id4基因在正常人骨髓细胞和Hek937细胞系中呈完全非甲基化状态,在4个血液肿瘤细胞系K562、HL-60、Ramous 和CA46中均呈甲基化状态.结论:所检测的4种血液肿瘤细胞系中,Id4基因的甲基化状态与正常人骨髓细胞和非肿瘤细胞系完全不同,Id4基因甲基化模式的改变与造血细胞恶变的发生密切相关.
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Id4基因甲基化在监测异基因外周血干细胞移植治疗急性白血病疗效中的意义
本研究探讨和验证Id4基因甲基化在急性白血病(AL)患者异基因外周血干细胞移植后疗效监测中的意义.对29例接受异基因外周血干细胞移植的AL患者,用甲基化特异性PCR(MS-PCR)方法检测其移植前、移植后1、3、6(和12)个月的骨髓Id4基因甲基化状态,并随诊分析.结果表明:29例AL患者中有18例患者移植前Id4基因呈甲基化,其中8例患者在移植后再次出现Id4基因甲基化;而11例移植前Id4基因呈非甲基化的患者中只有1例在移植后再次甲基化;移植后出现Id4基因甲基化的9例患者中,有4例患者出现随访期内的白血病复发,而移植后Id4基因仍呈非甲基化的20例患者在随访期间无1例复发,两组间差异有统计学意义;移植后再次出现Id4基因甲基化的时间多在移植后6个月到1年.结论:对AL患者在移植前后进行Id4基因甲基化检测具有重要意义,选择移植前Id4基因非甲基化的患者进行移植将可能有益于减少白血病复发的机会,移植后进行Id4基因甲基化检测对于在临床预测白血病的复发具有重要意义.
关键词： ID4基因 ID4基因甲基化 急性白血病 异基因外周血造血干细胞移植 -
去甲基化的MDS细胞系和2例MDS患者的ID4基因甲基化的临床意义
目的:探讨去甲基化的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome MDS)患者来源的细胞系MUTZ-1和2例MDS患者的ID4基因表达及去甲基化状态影响的临床意义,为MDS患者去甲基化治疗提供理论依据.方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)及逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)方法检测MDS细胞系MUTZ1中ID4基因,及l例AA患者骨髓细胞及NBM细胞中的甲基化及表达情况.应用RT-PCR方法检测ID4基因在去甲基化药物地西他滨处理的MUTZ-1中的表达情况.运用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法检测2例MDS患者去甲基化治疗前后ID4基因甲基化状态.结果:ID4基因在MUTZ1中呈完全甲基化且表达极弱,在AA患者骨髓细胞和NBM细胞呈完全非甲基化且有较强表达.去甲基化处理MUTZ-1后,随着地西他滨浓度增强ID4基因的表达呈现逐渐增强的表现;BSP检测2例MDS患者表明,去甲基化药物地西他滨治疗后其ID4基因甲基化阳性频率均较初治时明显降低.结论:ID4基因启动子区的高甲基化状态抑制了ID4表达,但这种抑制状态可以通过去甲基化药物处理而改变.ID4作为MDS抑癌基因,进一步提示其甲基化可以成为MDS患者治疗方案选择及疗效评估的指标.
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DNA结合抑制因子4基因甲基化状态检测在急性白血病中的意义
目的探讨DNA结合抑制因子4(Id4)基因甲基化与急性白血病(AL)的关系.方法采用甲基化特异性(MS)-PCR对正常人骨髓、外周血、外周血干细胞(PBSC),以及AL细胞系和AL患者的骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况分析.结果Id4基因在正常骨髓、外周血和PBSC中呈完全性非甲基化状态.25例初治急性髓系白血病中有21例Id4基因甲基化,甲基化比例84%.14例初治急性淋巴细胞白血病中有12例Id4基因甲基化,甲基化比例达86%.8例复发和难治的AL患者该基因均呈甲基化.在K562和HL60细胞系中均呈完全甲基化,在Hek937细胞系则呈完全非甲基化.结论与正常人不同,在AL患者及白血病细胞系中,Id4基因启动子区都发生了高程度的甲基化改变,Id4基因甲基化模式的改变与AL的发生密切相关.
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基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定
目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR)+164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.
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ID4基因表达谱的生物信息学分析
目的:分析ID4基因在正常组织细胞和癌变组织细胞中的表达情况,为研究该基因的表达调控机制奠定基础.方法:采用生物信息学方法,利用开放性的数据库包括Gene expression omnibus(GEO)、Affymetrix基因芯片表达数据库、人类基因组数据库(GeneBank)、基因表达数据库SAGE、GeneCard、InterPro、ProtoNet、UniProt和BLOCKS.结果:ID4基因在多种神经系统肿瘤细胞中的表达高于正常脑组织(209/3,148/3,123/3,72/3,64/3,45/3);而甲状腺滤泡癌的表达要低于正常甲状腺组织(35/172);正常乳腺组织要明显低于转移乳腺癌和原发乳腺癌的表达(10/36,10/34);正常肺组织的表达高于肺腺癌(11/4).此外,ID4基因在正常淋巴结、胚胎干细胞等细胞中也有表达.结论:生物信息学可以用来方便快捷地分析基因的表达谱;ID4基因的表达具有组织特异性.
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慢性白血病Id4甲基化研究
目的 探讨Id4基因在慢性白血病患者中的甲基化情况.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PER),对初发9例慢淋白血病(CLL)和18例慢粒白血病(CML)患者的骨髓进行Id4基因甲基化检测,以正常骨髓作为对照.结果 Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态,在9例CLL患者中全部检测到ld4基因甲基化,而在18例CML患者中,检测到12例Id4基因甲基化.结论 慢性白血病患者骨髓Id4基因发生了不同程度的甲基化改变,CLL和CML患者的甲基化发生比例不同.
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骨髓增生异常综合征患者Id4基因甲基化研究
目的 探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者中Id4基因甲基化状态.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对56例不同类型MDS患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测,并以非恶性血液肿瘤骨髓作为对照.结果 Id4基因在非恶性血液肿瘤骨髓中呈完全性非甲基化状态,在MDS各种类型中,骨髓中原始细胞比例分别低于和高于5%的两组患者中,Id4甲基化差异有显著性意义.结论 骨髓原始细胞比例高的MDS患者骨髓Id4基因甲基化发生率高.
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分化抑制因子Id4对K562细胞株凋亡的影响
目的 探讨Id4基因的反义核酸对人红白血病K562细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体介导的反义寡核苷酸转染DNA重组技术,将人反义Id4基因插入到真核表达载体pXJ41-neo上,重组质粒和空载体分别转染K562细胞,加入凋亡诱导剂三尖杉酯碱(HT)后采用流式细胞术、TUNEL和免疫印迹(Western blot)技术检测细胞的凋亡率以及相关蛋白Bcl-xl、c-Myc、p27的表达变化.结果 获得了pAId4(反义基因重组质粒)和pK562(对照)克隆细胞株;加入诱导剂HT后,反义寡核苷酸组的凋亡率明显增高到43.5%;检测K562细胞凋亡过程中,Bcl-xl蛋白在pAId4细胞株中表达减低.结论 反义Id4基因的转入对K562细胞起到诱导凋亡作用,并推测Id4在K562细胞中可能通过影响Bcl-xl的表达量,进一步诱导细胞凋亡.
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Id4对K562细胞增生的影响及其机制的探讨
为了探讨Id4基因的反义核酸对人红白血病K562细胞增生的作用,用DNA重组技术将人反义Id 4基因插入到真核表达载体pXJ41-neo上,重组质粒和空载体分别转染K562细胞,得到pAId4 和pK562(对照)克隆细胞株.发现:pAId4的生长受到抑制,倍增时间加长.免疫印迹实验分析相关蛋白的表达,其中CDK4和CyclinD1在pAId4细胞中的表达量均低于对照细胞pK562,而RB蛋白在pAId4细胞中的表达量高于对照细胞pK562,揭示了反义Id4引起细胞出现生长抑制的可能机制,并探讨了Id4基因对人红白血病K562细胞增生的具体作用.研究结果对造血干细胞的体外扩增、分化及红白血病的基因治疗均有重要的参考价值.
