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去甲基化在白血病上的研究进展
DNA甲基化是白血病表观遗传学改变中较常见的改变.在白血病的发展中,甲基化对基因表达的调控和基因结构的稳定起着重要的作用.造血干细胞移植和化疗是目前治疗白血病的常用方法.遗憾的是,合适的移植供者难以找到,而且白血病的复发和耐药是化疗中的大问题.由于甲基化的可逆性,降低甲基化水平的药物就成了治疗白血病的新手段.地西他滨是用于降低甲基化的常用药物.本文对甲基化与肿瘤、甲基化与血液病,甲基化的检测方法和去甲基化治疗等问题进行了综述.
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地西他滨在AML中的相关研究
表观遗传是一种不涉及DNA序列的变化,具有可逆性和可遗传性的基因表达调控机制.DNA甲基化是目前人们研究为深入的一种表观遗传学修饰方式,已被证实与多种肿瘤的发生密切相关.地西他滨(DAC)作为一种甲基转移酶抑制剂,与传统化疗药物相比,具有不同的作用机制,显示了靶向性特点,代表了一种新的治疗策略.本文主要就DAC的抗白血病机制、在AML治疗中的应用及效果等方面进行综述.
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三氧化二砷去甲基化作用对白血病细胞株HL-60中SHP-1和c-kit基因表达的影响
本研究旨在探讨SHP-1及C-kit基因在急性白血病细胞中的表达水平及三氧化二砷(As2O3)去甲基化作用对SHP-1及C-kit表达的影响.用RT-PCR方法检测药物处理的HL-60细胞组与对照组SHP-1、C-kit基因的mRNA的表达水平.用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测HL-60细胞中SHP-1基因的甲基化状态的变化.结果表明,在原本不表达SHP-1 mRNA的HL-60细胞中,经过As2O3的去甲基化作用后,SHP-1得到表达,而使原来高表达的C-kit mRNA的表达水平随之下降.当1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L As2O3分别作用于白血病细胞株时,去甲基化作用增强,SHP-1 mRNA的表达水平呈上升趋势,C-kit mRNA的表达水平呈下降趋势,经两两比较,二者间有统计学意义(P＜0.05).结论:HL-60细胞株中SHP-1 mRNA表达缺如,经去甲基化作用后表达恢复,说明SHP-1基因高度甲基化与白血病发生有关；在白血病形成中可能存在C-kit mRNA表达的异常增高.As2O3对SHP-1与C-kit的表达水平的影响呈剂量依赖性,浓度越高,SHP-1平均表达水平越高,C-kit mRNA表达水平越低,在特定的浓度下,呈现时间依赖性；SHP-1 mRNA与C-kit mRNA表达呈负相关,提示白血病细胞中SHP-1表达降低或缺如削弱了对C-kit信号通路的负调控而在白血病形成中发挥作用.
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地西他滨对白血病细胞DKK1基因去甲基化的实验研究
目的:探讨地西他滨对急性髓系白血病细胞株HL-60中DKK1的表达及其下游Wnt信号通路的影响.方法:采用流式细胞术(FCM)和DNA Ladder分析检测不同浓度地西他滨对HL-60细胞凋亡的影响,甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测DKK1基因甲基化状态,qRT-PCR方法检测mRNA表达水平,Western-blot方法检测蛋白的表达变化.结果:FCM检测结果表明,不同浓度地西他滨作用于HL-60细胞48 h后,地西他滨组的早期凋亡细胞数明显增多(P ＜0.05);DNA梯度检测结果发现,地西他滨组出现明显的细胞凋亡特异性梯度条带;MS-PCR检测发现,DKK1基因发生去甲基化,RT-PCR和Wertern blot检测显示mRNA表达水平增高,DKK1蛋白表达增加,β-catenin及C-MYC蛋白表达降低.结论:地西他滨可以通过DKK1基因去甲基化及抑制Wnt通路的作用,促进HL-60细胞凋亡.
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miRNA-663在不同的白血病细胞系的表达水平及其生物学功能的初步研究
本研究通过5-氮杂胞苷(5-aza)处理K562细胞系,寻找去甲基化后表达上调的microRNA(miRNA),检测其在正常人、慢性髓系白血病(CML)病人和白血病细胞系的表达水平,探讨其对K562细胞系增殖的影响.采用miRNA芯片筛选5-aza处理后表达上调的miRNA,结合生物信息学在上调的芯片结果中选取miRNA前体上游带有CpG岛的miR-663、miR-638及miR-92b,通过荧光实时定量PCR的方法验证在芯片结果中这3个上调的miRNA,证实miR-663在去甲基化后表达上调.分别在K562细胞系、U937细胞系、Kasumi细胞系、初治CML患者外周血白细胞及正常人骨髓白细胞检测miR-663的表达水平.通过甲基化特异性PCR(MSP)的方法,在K562细胞系检测miR-663前体上游CpG岛是否存在甲基化.通过瞬时转染的方法在K562细胞系过表达合成的miR663成熟体,观察其对K562细胞增殖的影响.结果表明:去甲基化后能在K562细胞系上调miR-663的表达水平,与正常人骨髓白细胞相比,初治CML病人的白细胞、白血病细胞系K562、U937及Kasumi的miR-663表达水平相对较低;MSP检测表明,在K562细胞系miR-663上游的CpG岛是甲基化的.体外K562细胞系过表达miR-663可以抑制K562细胞系的增殖.结论:在K562细胞系miR-663上游的CpG岛存在甲基化.与正常人相比,miRNA-663在CML病人、白血病细胞系K562、U937及Kasumi表达水平相对较低,5-aza可以上调miRNA-663在K562细胞系的表达,在K562细胞系过表达tniRNA-663可抑制K562细胞的增殖,提示miRNA-663在白血病中可能具有抑癌作用.
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地西他滨联合小剂量IA方案治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多的临床观察
目的:观察地西他滨联合小剂量去甲氧柔红霉素、阿糖胞苷(DAC+ IA)方案治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多的临床疗效.方法:回顾性分析2015年6月-2017年1月在西安交通大学第一附属医院血液科治疗的37例骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多患者,分别采用DAC+ IA方案(19例)和单用DAC(18例)方案治疗,观察其临床疗效和不良反应.结果:1-2疗程后,DAC+ IA组CR+ CRi率为57.9％,总反应率100％,骨髓病理组织幼稚细胞明显减少,外周血中性粒细胞、血红蛋白、血小板水平显著提高,完全缓解中位持续时间7.3月,无进展生存时间为10月,3例患者缓解后停止治疗,3.5月复发.DAC组CR+ CRi率为16.7％,总反应率38.9％,中位无进展生存时间为6月.3例患者达到完全缓解,中位时间4个月均进展为AML.两组患者常见的不良反应为骨髓抑制和感染,其差异无统计学意义.结论:DAC联合小剂量IA方案治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多,可延长患者生存期,改善生存质量,近期疗效显著,但远期疗效仍有待于异基因造血干细胞移植进行巩固.
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HOXA9在骨髓增生异常综合征中的表达及意义
目的:探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓中HOXA9基因和蛋白的表达模式及其与诊断、治疗的关系.方法:应用流式细胞术检测33例MDS患者、12例初治急性髓系白血病、20例免疫性血小板减少性紫癜和18名正常对照者的骨髓样本的HOXA9蛋白水平,利用实时荧光定量PCR检测HOXA9 mRNA的表达水平.结果:MDS患者HOXA9+/CD34+和HOXA9+/CD34+ CD38-比例均高于对照组(P＜0.05).HOXA9的mRNA相对表达量与蛋白水平相一致.未行地西他滨治疗的患者HOXA9+/CD34+为(50.64±27.59)％,HOXA9+/CD34+ CD38为(55.67 ±28.57)％,均高于正常对照组(P＜0.05).经地西他滨治疗患者的HOXA9+/CD34+和HOXA9+/CD34+ CD38-比例均低于未治组(P＜0.05).结论:HOXA9在MDS中异常高表达且与相关临床特征有相关,提示HOXA9在MDS诊治中具有指导意义.
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去甲基化和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂对K562细胞增殖和肿瘤相关基因表达的影响
为观察去甲基化和组蛋白乙酰化对白血病细胞系K562增殖及肿瘤相关基因表达的影响,本研究将处于对数生长期的K562细胞系与5-杂氯脱氧胞嘧啶(DAC)和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂-曲古抑菌素(trichostatin,TSA)共同培养,观察细胞生长指数并利用流式细胞术检测细胞周期变化;利用Atlas7742-1基因芯片筛查给药前后的基因表达差异.结果表明,DAC和TSA的联合应用能够抑制K562细胞的增殖,使大多数细胞阻滞在G0期,并促进多个基因的表达上调及少数基因表达下调.结论:去甲基化药物及组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂联合应用具有抗白血病作用,与基因芯片联合应用可以用来筛查白血病抑癌候选基因.
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去甲基化的MDS细胞系和2例MDS患者的ID4基因甲基化的临床意义
目的:探讨去甲基化的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome MDS)患者来源的细胞系MUTZ-1和2例MDS患者的ID4基因表达及去甲基化状态影响的临床意义,为MDS患者去甲基化治疗提供理论依据.方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)及逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)方法检测MDS细胞系MUTZ1中ID4基因,及l例AA患者骨髓细胞及NBM细胞中的甲基化及表达情况.应用RT-PCR方法检测ID4基因在去甲基化药物地西他滨处理的MUTZ-1中的表达情况.运用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法检测2例MDS患者去甲基化治疗前后ID4基因甲基化状态.结果:ID4基因在MUTZ1中呈完全甲基化且表达极弱,在AA患者骨髓细胞和NBM细胞呈完全非甲基化且有较强表达.去甲基化处理MUTZ-1后,随着地西他滨浓度增强ID4基因的表达呈现逐渐增强的表现;BSP检测2例MDS患者表明,去甲基化药物地西他滨治疗后其ID4基因甲基化阳性频率均较初治时明显降低.结论:ID4基因启动子区的高甲基化状态抑制了ID4表达,但这种抑制状态可以通过去甲基化药物处理而改变.ID4作为MDS抑癌基因,进一步提示其甲基化可以成为MDS患者治疗方案选择及疗效评估的指标.
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DNA去甲基化与肿瘤治疗的研究进展
近年来大量的研究结果显示,肿瘤的发生不但存在遗传学上的改变,而且存在表观遗传学的改变[1].遗传学改变是指基于基因序列改变而导致基因表达水平的变化,如基因突变、杂合性缺失、微卫星不稳定性等.表观遗传学是非基因序列改变所导致的基因水平的变化,如组蛋白修饰、染色质重塑、DNA甲基化等染色质结构上的变异.其中DNA甲基化异常已成为DNA突变、缺失以外导致抑癌基因失活的第三大机制,主要表现为肿瘤细胞中普遍性低甲基化和CpG岛区域性高甲基化.研究提示肿瘤抑癌基因启动子区域性高甲基化是肿瘤抑癌基因失活的重要途径,而抑癌基因的去甲基化已成为近年来研究和开发抗癌药物的新靶点.
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5-杂氮胞苷诱导人淋巴细胞系Molt-4细胞PD-1基因启动子去甲基化及PD-1蛋白表达的影响
目的 以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(PD-1)基因肩动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的关系.方法 以不同浓度的5-Zac(0、5、10μmoL/L)作用于体外培养的Molt-4细胞72 h,流式细胞术(FCM)检测细胞表面表达PD-1的Molt-4细胞比例和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测5-Zac作用后PD-1基因mRNA的转录水平;亚硫酸氧钠处理各组Molt-4细胞DNA,PCR扩增与转录因子Brn-2结合的PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态.结果 0、5、10μmol/L的5-Zac作用于Molt-4细胞72 h后,PD-1在细胞表面的表达率分别为1.13%4±0.01%、18.96%±1.87%、63.09%±6.25%,并呈现浓度依赖性(P<0.05);PD-1基因mRNA表达量显著增加;细胞凋亡检测结果显示与未处理组相比,5-Zac处理72 h后Molt-4细胞的凋亡率显著增加,3组凋亡率分别为1.9%4±0.06%、8.98%4±1.36%、24.5%4±3.68%,差异有统计学意义(P<0.01);3组DNA亚硫酸氢钠测序结果表明,5-Zac处理后,与转录因子Bin-2结合位置的CG点明显受到去基化影响,其去甲基化概率与周围其他CG点去甲基化概率比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 甲基化抑制剂5-Zac可导致体外培养的淋巴细胞系Molt-4细胞表面PD-1表达显著增加,PD-1基因mRNA表达增加,细胞凋亡率增高;PD-1基因活化和表达的增加可能与5-Zac降低PD-1基因启动子上与转录因子Bin-2结合位置的CG点甲基化水平,从而促进Brn-2与基因启动子结合,使转录表达增加有关.
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DNA甲基化在白血病中临床研究进展
越来越多研究表明DNA甲基化状态异常尤其是抑癌基因的高甲基化失表达在白血病的发生发展、诊断、检测微小残留病(minimal residual disease,MRD)、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用[1].近年来DNA甲基化谱研究的进展以及尝试利用去甲基化药物辅助治疗白血病越来越引人注目[1].本文就近年来DNA异常甲基化在白血病临床意义研究及检测方法进展作一综述.
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同型半胱氨酸与疾病的关系
同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)是蛋氨酸去甲基化后形成的一种含硫氨基酸,属于蛋氨酸循环的中间产物.六十年代末,Mc Cully从病理上发现高胱氨酸尿症和胱硫醚尿症患者早期即可发生全身动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和血栓形成,七十年代初他又通过动物模型证实血中HCY蓄积可导致血管损害,八十年代人们提出高HCY血症是AS和冠心病(comnary heart disease,CHD)的一个独立危险因素.
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骨髓增生异常综合征的去甲基化治疗
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性后天性克隆性恶性疾病，其基本病变是克隆性造血干、祖细胞发育异常，导致无效造血以及恶性转化危险性增高。MDS作为恶性克隆性疾病，只有异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）才可以治愈。而MDS主要发生于老年人群，多数患者由于年龄、体能状况及严重并发症无法接受异基因造血干细胞移植治疗。在去甲基化药物（HMAs）出现之前，大多数患者只能采取支持治疗作为主要甚至唯一的治疗手段。
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地西他滨单药及联合AAG方案治疗初治急性髓系白血病的临床观察
目的 探讨地西他滨单药及联合AAG方案治疗初治急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasia syndrome,MDS)转化急性髓系白血病(post MDS-AML)的临床疗效和安全性.方法 回顾性分析2009年8月至2012年4月苏州大学附属第一人民医院血液科收治的18例初治AML(MDS转化12例)患者临床资料,应用地西他滨[20 mg·(m2)-1·d-1,qd×(5~9)d,维持1 h以上]单药或联合AAG方案(阿糖胞苷10 mg/m2,q12 h×14 d,阿克拉霉素20 mg,qod×4 d,G-CSF 300 μg,qd×14 d).结果 单药地西他滨11例,完全缓解(CR)4例(36.4%),部分缓解(PR)3例(27.3%),总有效率(OR)为63.6%;地西他滨联合AAG方案治疗11例,CR 5例(45.5%),PR 3例(27.3%),OR为72.7%,差异无统计学意义(P>0.05);3例年龄大于60岁的患者,CR 1例,PR 1例,NR 1例.4度血液系统毒副反应11例(61.11%),3~4度感染10例(55.56%),2度胃肠道毒副作用1例(5.56%),1度膀胱毒副作用2例(11.1%),1度皮肤软组织感染2例(11.1%).6/18例(CR 5例,PR 1例)接受造血干细胞移植(同胞全相合4例,父供子半相合1例,双份脐血1例),4例无病生存;1例8个月后复发;脐血1例造血未重建,并发感染死亡.随访至2012年5月31日,14例存活,1例移植后复发,3例早期死亡.中位生存:125 d(41~726 d).结论 单药地西他滨或联合AAG方案用于治疗初治AML和post MDS-AL患者具有一定的有效率,化疗副作用均能耐受.适用于不能耐受标准方案化疗的老年患者.对于年轻的患者地西他滨能够降低肿瘤负荷,延缓疾病进展,为后期行造血干细胞移植的创造机会.
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非小细胞肺癌患者外周血黑色素瘤抗原基因启动子去甲基化模式的研究
目的 探讨外周血黑色素瘤抗原基因启动子区CpG岛去甲基化的状态在肺癌诊断和预后评估中的价值.方法 用甲基化特异性PCR(MSP)检测49例非小细胞肺癌患者外周血MAGE-A1、MAGE-A3基因启动子区CpG岛去甲基化的状态,分析与临床参数的关系,每例患者进行24个月的随访.结果 49例非小细胞肺癌患者分别有26例(53.1％)外周血MAGE-A1启动子区CpG岛启动子呈去甲基化状态,24例(49％) MAGE-A3启动子区CpG岛呈去甲基化状态；22例肺结核、15例肺脓肿、34例肺炎和30例健康体检者外周血标本均呈现甲基化(100％).MAGE-A1、MAGE-A3启动子区CpG岛启动子去甲基化模式均与肺癌是否转移、TNM分期相关,与患者年龄、性别和肺癌组织学分型无关.24个月的随访结果显示,肺癌组MAGE-A1、MAGE-A3启动子区CpG岛启动子呈去甲基化模式患者较呈甲基化患者预后不良.结论 MAGE基因启动子区CpG岛去甲基化的状态可作为检测肺癌患者外周癌细胞的标记物,同时,检测结果有助于对肺癌患者的预后进行判断.
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去甲基化在治疗相关白血病治疗中的作用七例报道并文献复习
治疗相关白血病（ therapy-related leukemia ， TRL）为原发肿瘤或非肿瘤性疾病中给予细胞毒化疗和（或）放疗后并发的临床综合征，包括治疗相关急性髓细胞白血病[AML（t-AML）]、治疗相关骨髓异常增生综合征[MDS（t-MDS）]和治疗相关MDS和骨髓增殖性肿瘤[MDS/MPN（t-MDS/MPN）][1]，其中以t-AML、t-MDS多见。TRL约占全部白血病的10%～20%[2-3]。近年来，由于强烈化疗和放疗的应用，肿瘤患者的缓解率和生存期有了较大的提高，但同时放化疗后的白血病也随之增多。现报道我科收治的7例TRL。
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骨髓增生异常综合征发病机制与去甲基化药物治疗
骨髓增生异常综合征（ myelodysplastic syndromes ， MDS）是一组异质性很强的造血干细胞（ hematopoietic stem cell，HSC）的克隆性疾病。根据WHO关于血液肿瘤的分类，MDS属于髓系肿瘤，被分成了五种类型，都以骨髓增生而外周血细胞减少、病态造血及较高的白血病转化风险为特征。根据通用的国际预后评分系统（ IPSS）可以将MDS分成低危（包括低危和中危-1）和高危（包括中危-2和高危）两个亚群。
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大肠癌组织微卫星不稳与hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态
目的:探讨大肠癌组织微卫星DNA不稳与hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态的关系.方法:采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳;采用甲基化特异性PCR方法检测hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态.结果:正常大肠黏膜未见hMLH1和hMSH2基因启动子区的高甲基化.76例大肠癌中检出hMLH1高甲基化8例,占10.5%,而且均为去甲基化和高甲基化并存,未见有hMSH2高甲基化者.检出MSI 20例,检出率为26.3%.将MSI分为高频率MSI(MSI-H,≥2个位点)10例、低频率MSI(MSI-L),仅为1个位点10例和MSI阴性(MSS)56例三组,结果右侧大肠癌hMLH1高甲基化检出率(23.1%)显著高于左侧大肠癌(4.0%,P＜0.05).MSI-H组hMLH1高甲基化的检出率(8/10)显著高于MSI-L(2/10)和MSS组(6/56,P＜0.01-0.001).结论:hMLH1高甲基化与右侧大肠癌的发生有关,可能参与了MSI病理途径,而hMSH2甲基化状态可能与MSI途径无关.
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EGCG对肺癌细胞WIF-1基因启动子区的去甲基化作用
目的 Wnt信号通路在许多恶性肿瘤包括肺癌的发生发展过程中发挥作用,WIF-1可以抑制Wnt通路的活性,但启动子区高甲基化导致WIF-1基因沉默,使Wnt信号通路异常激活并引起肿瘤.EGCG是一种去甲基化因子,本实验拟验证其去甲基化和对WIF-1基因的再激活作用.方法 利用甲基化特异性PCR,DNA测序及RT-PCR分析技术来测定WIF-1基因启动子区的去甲基化及WIF-1的表达,利用Westernblotting分析技术测定细胞质β-catenin蛋白的表达.结果 EGCG的浓度在0～50 μM时,在72 h培养期内对H460、A549及HCT116细胞系无细胞毒作用.在H460及A549细胞系内发现启动区域的甲基化.EGCG处理H460后WIF-1启动区域甲基化水平由77.6％降至27.6％ (P ＜0.05),而处理A549后则由76.5％降至28.6％ (P ＜0.05).使用EGCG后显示肺癌细胞系WIF-1启动子区去甲基化及WIF-1表达恢复.结论 EGCG在逆转WIF-1基因启动子甲基化并再激活WIF-1基因中有潜在的治疗作用.
