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巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化
目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP, nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态.方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变.设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,后经凝胶电泳检测目的片段.结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化.结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析.
关键词： 巢式甲基化特异性PCR(nMSP) WIF-1 基因 甲基化 -
急性髓系白血病中DKK-3和WIF-1甲基化状态和mRNA表达的研究
目的:研究DKK-3和WIF-1在急性髓系白血病(AML)患者中的启动子甲基化状态和mRNA表达情况及其临床意义.方法:用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测56例AML患者骨髓标本和20例缺铁性贫血患者(对照组)骨髓标本中DKK-3和WIF-1启动子甲基化状态;用实时定量PCR检测上述标本中β-catenin、DKK-3和WIF-1mRNA表达情况,并分析其与临床资料及生存时间的关系.结果:AML组中DKK-3和WIF-1启动子甲基化率明显高于对照组(x2=15.330,P＜0.001;x2 =17.371,P＜0.001),且与性别、年龄、临床分型无相关性.DKK-3和WIF-1 mRNA相对表达量在AML患者中依次为0.840±0.320和0.792±0.313,明显低于对照组的1.134±0.392和1.047±0.334(t=3.415,P=0.000;t=3.070,P=0.003).AML患者骨髓标本3-catenin的mRNA相对表达量为0.756±0.304,高于对照组骨髓标本表达量0.342±0.105(t =5.943,P=0.001),且AML骨髓标本中DKK-3和WIF-1 mRNA相对表达量和β-catenin相对表达量呈均呈负相关性(r=-0.543;r=-0.562).Kaplan-Meier生存曲线分析显示,DKK-3甲基化阳性组AML患者总体生存时间短于阴性组患者(x2=3.957,P=0.042),而WIF-1甲基化阳性组AML患者总体生存时间亦短于阴性组患者(x2=4.520,P=0.029).结论:AML患者中Wnt/β-catenin信号通路存在有异常激活,DKK-3和WIF-1启动子甲基化可能参与了Wnt通路激活及AML的发病过程并影响其总体预后.
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骨肉瘤中 WIF-1甲基化及 WIF-1、β-catenin 蛋白表达的研究
目的：检测骨肉瘤中WIF-1基因启动子区甲基化状态及WIF-1蛋白、β-catenin蛋白表达情况，探讨它们之间的相关性及其与骨肉瘤发生发展的关系，为骨肉瘤的分子靶向治疗提供理论依据。方法收集青岛大学2008年1月至2013年6月骨肉瘤组织50例，并取骨软骨瘤组织30例作为对照，应用甲基化PCR和免疫组化两种方法，检测骨肉瘤组及对照组WIF-1基因启动子区甲基化状态及WIF-1蛋白、β-catenin蛋白表达情况。结果骨肉瘤和骨软骨瘤组织的WIF-1启动子甲基化阳性率分别为70.0%和20.0%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。WIF-1启动子甲基化阳性率随着骨肉瘤分期的增加而升高。骨肉瘤和骨软骨瘤组织中WIF-1蛋白表达率分别为42.0%和70.0%，两者之间差异有统计学意义（P＜0.05），且WIF-1启动子甲基化阳性与WIF-1蛋白表达呈明显负相关（P＜0.05）。骨肉瘤和骨软骨瘤组织中β-catenin蛋白表达率分别为70.0%和43.3%，两者之间差异有统计学意义（P＜0.05），WIF-1启动子甲基化与β-catenin蛋白表达呈正相关（P＜0.05）。结论 WIF-1基因甲基化状态可能抑制了WIF-1蛋白的表达，从而引起β-catenin蛋白在在胞质中异常积聚表达，从而使经典Wnt信号转导通路过度激活，参与细胞的生长、增殖，导致骨肉瘤的发生发展。
关键词： 骨肉瘤 WIF-1 β-catenin蛋白 免疫组织化学 -
WIF-1对人骨肉瘤 MG-63细胞中β-catenin表达的作用研究
目的： WIF-1是Wnt信号通路中常见抑制因子之一，本实验研究WIF-1对人骨肉瘤MG-63细胞Wnt信号通路中β-catenin表达量的影响。方法细胞培养人骨肉瘤MG-63细胞，0 ng/ml浓度的WIF-1作为空白对照组，分别以0、48、60、80、120 ng/ml浓度的WIF-1刺激MG-63细胞，分别用FQ-PCR及Western blot法从基因水平、蛋白水平测定细胞中β-catenin的表达量；细胞培养人骨肉瘤MG-63细胞，用WIF-1刺激细胞，分别在第0、12、24、48、72、96 h对各组细胞进行计数，观察空白组及WIF-1刺激组细胞数目的变化情况。结果不同浓度（0、48、60、80、120 ng/ml）WIF-1刺激下，FQ-PCR法显示β-catenin mRNA的相对表达总量2-ΔΔCT分别为1、0.55±0.30、0.44±0.24、0.35±0.15、0.24±0.21。与空白组相比较，WIF-1刺激下β-catenin mRNA表达量均降低（P＜0.05）。随着WIF-1浓度的增加，β-catenin mRNA表达量下降，但组间的抑制作用无明显差别（P＞0.05）；Western blot法显示β-catenin/β-actin蛋白相对表达量分别为1.40±0.11、0.86±0.10、0.51±0.11、0.45±0.06、0.18±0.03；与空白组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组及WIF-1刺激组细胞数目有差异，空白组细胞增殖情况优于WIF-1刺激组。结论 WIF-1可降低人骨肉瘤MG-63细胞Wnt信号通路中β-catenin表达量，并抑制人骨瘤MG-63细胞的增殖。
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Wnt信号参与压力超负荷诱导的小鼠心力衰竭过程
目的 通过检测wnt11、WIF-1及β-catenin在压力超负荷心力衰竭小鼠中的表达探索wnt信号在心力衰竭发生过程中的作用.方法 主动脉缩窄法(transverse aortic constriction,TAC)建立C57/BL6小鼠心衰模型,假手术组为对照组.彩色多普勒采集心脏指标,取建模前后的血浆样本及心肌样本,测定血液中wnt11、WIF-1浓度及心肌组织中wnt11、WIF-1及β-catenin表达情况.结果 与假手术组比较,TAC组小鼠wnt 11、β-catenin的表达明显高于假手术组,而WIF-1的表达明显下降.结论 wnt途径信号分子参与压力超负荷介导的心力衰竭发生发展过程,相关生物标记物可能对心力衰竭的治疗有指导意义.
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EGCG对肺癌细胞WIF-1基因启动子区的去甲基化作用
目的 Wnt信号通路在许多恶性肿瘤包括肺癌的发生发展过程中发挥作用,WIF-1可以抑制Wnt通路的活性,但启动子区高甲基化导致WIF-1基因沉默,使Wnt信号通路异常激活并引起肿瘤.EGCG是一种去甲基化因子,本实验拟验证其去甲基化和对WIF-1基因的再激活作用.方法 利用甲基化特异性PCR,DNA测序及RT-PCR分析技术来测定WIF-1基因启动子区的去甲基化及WIF-1的表达,利用Westernblotting分析技术测定细胞质β-catenin蛋白的表达.结果 EGCG的浓度在0～50 μM时,在72 h培养期内对H460、A549及HCT116细胞系无细胞毒作用.在H460及A549细胞系内发现启动区域的甲基化.EGCG处理H460后WIF-1启动区域甲基化水平由77.6％降至27.6％ (P ＜0.05),而处理A549后则由76.5％降至28.6％ (P ＜0.05).使用EGCG后显示肺癌细胞系WIF-1启动子区去甲基化及WIF-1表达恢复.结论 EGCG在逆转WIF-1基因启动子甲基化并再激活WIF-1基因中有潜在的治疗作用.
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WIF-1心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析
目的 建立心脏特异表达WIF-1转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用. 方法 RT-PCR法克隆人WIF-1基因,把WIF-1基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转WIF-1 C57BL/6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Western blot检测基因表达水平,超声检测不同月龄WIF-1转基因小鼠心脏结构及功能变化. 结果 建立了2个系的心脏特异表达WIF-1转基因小鼠.心脏超声检查证实,WIF-1转基因小鼠与对照小鼠比较,左心室重量减小,舒张期左室内径和容积变小,每搏输出量和心输出量减小.结论 WIF-1基因是心脏功能的负调控因子.
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WIF-1研究进展
WIF-1是Wnt信号通路上的拮抗物之一,可以阻断Wnt的经典通路和非经典通路.目前在人类多种肿瘤的研究发现WIF-1表达异常.WIF-1 (Wnt inhibitory factor-1), sFBP (Frizzled related protein)和CER (Cerberus)属于Wnt拮抗物家族,通过直接与Wnt蛋白相连从而阻止Wnt与受体蛋白复合物相连,使细胞质中的β-catenin由于磷酸化而不能积累,进而阻断了经典通路和非经典通路.WIF-1可能与中胚层的发生以及肿瘤细胞的生长分化有关.Wnt家族其他成员已经被证实与早期冠心病、Ⅱ型糖尿病、肥胖症、骨质疏松症等相关.因此了解WIF-1在通路上的更多信息,解释WIF-1调节Wnt信号通路的机理和过程,为疾病治疗和预防以及药物开发提供新的方法.
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乳腺癌WIF-1基因表达及其临床病理特征与该基因启动子区域甲基化的关联*
目的：研究WIF-1（Wnt inhibitory factor-1）mRNA在乳腺癌组织中的表达及其启动子区域甲基化情况，进一步探讨WIF-1基因甲基化与乳腺癌临床病理特征的关系。方法：收集2009年9月1日至2009年12月30日青岛大学附属医院乳腺外科手术切除新鲜组织标本69例，其中良性病变组织9例，乳腺癌及癌旁组织各30例，应用RT-PCR及甲基化特异性PCR（methyla-tion specific PCR，MSP）检测乳腺癌组织、相应癌旁组织和乳腺良性病变组织中WIF-1mRNA表达及其启动子甲基化情况。结果：癌组织中WIF-1基因表达率明显低于相应癌旁组织及乳腺良性病变组织，具有显著性差异（χ2=41.786，P<0.05）；与其他两组相比甲基化率在癌组织中明显升高（矫正χ2=16.484，P<0.05）；WIF-1基因表达下降与其异常甲基化存在明显关联（P=0.023）；WIF-1异常甲基化与乳腺癌发病年龄、肿瘤分级、组织分型和淋巴结转移无相关性（P>0.05）。结论：异常甲基化可能是乳腺癌WIF-1基因表达下降的重要原因，是乳腺癌发生、发展的重要机制。
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WIF-1基因甲基化及Wnt-5 a蛋白在软骨肉瘤病人中表达的临床意义
目的：研究WIF-1基因甲基化及Wnt-5a蛋白在软骨肉瘤病人中的表达情况,探讨二者在软骨肉瘤病人中的临床意义。方法：选取我院病理科2008-06~2012-06收治的软骨肉瘤病人43例,另选取软骨瘤病人43例作为对照。收集病人的病历资料及临床病理表现,通过甲基化特异性PCR检测法及免疫组织化学方法,监测两组病人WIF-1基因和Wnt-5a蛋白表达情况。结果：软骨肉瘤WIF-1基因甲基化阳性率高于软骨瘤,比较差异具有统计学意义(χ2=5.658,#P=0.003)；软骨肉瘤Wnt-5a蛋白表达阳性率高于软骨瘤,比较差异具有统计学意义(χ2=4.656,*P=0.006)。黏液型软骨肉瘤Wnt-5a蛋白表达阳性率明显高于普通型软骨肉瘤,差异具有统计学意义(χ2=4.941,#P=0.002)。发生浸润转移的软骨肉瘤病人Wnt-5a蛋白表达阳性率高于未发生浸润转移的病人(χ2=4.681,P=0.003)。结论：WIF-l基因的甲基化可能导致Wif-l蛋白表达下降,在软骨肉瘤早期作用；Wnt-5a蛋白表达可能使肿瘤更具有侵袭性,二者可能存在协同作用。
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转入WIF-1或5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的肿瘤生长
背景：WIF-1是一种抑癌基因，由于启动子过度甲基化从而导致其在大多数肿瘤中的表达下调，而DNA甲基化抑制剂可使一些基因发生去甲基化从而恢复其表达。
目的：在骨肉瘤动物模型中转入WIF-1或使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化处理后，观察瘤体的病理学差异及WIF-1 mRNA和蛋白的表达变化。
方法：建立鼠骨肉瘤模型，分为3组，对照组：不做任何处理；5-氮杂-2’-脱氧胞苷组：每只每日注射适量5-氮杂-2’-脱氧胞苷去甲基化剂；WIF-1组：每只每日注射适量Wnt/β-catenin信号转导通路抑制剂WIF-1。用药后第7天开始每7 d称裸鼠体质量，测量肿瘤短径(a)和长径(b)，分别计算各组肿瘤的相对体积，计算用药后第7，14，21，28，56天的肿瘤相对增长率。分别于用药后第7，14，21，28，56天5个时间点脱颈处死每组各4只裸鼠，剥取肿瘤组织称瘤质量，对瘤体做病理分析，检测用药第56天3组骨肉瘤组织中WIF-1蛋白、WIF-1 mRNA的表达情况。
结果与结论：①用药组与对照组相比，第7，14，21，28，56天的裸鼠体质量有所增加，但用药组与对照组之间差异无显著性意义。②用药组的肿瘤体积较对照组明显减小，用药组WIF-1 mRNA、WIF-1蛋白表达较对照组均出现不同程度的升高。③结果表明 WIF-1的启动子区基因甲基化是骨肉瘤发生发展的机制之一，在骨肉瘤动物模型中转入WIF-1或采用5-氮杂-2'-脱氧胞苷去甲基化处理可抑制肿瘤生长。 -
巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化
目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-l基因启动子的异常甲基化状态.方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变.设计针时甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,后经凝胶电泳检测目的片段.结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-l基因启动子的异常甲基化.结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析.
关键词： 巢式甲基化特异性PCR(nMSP) WIF-1 基因 甲基化 -
WIF-1与肿瘤关系的研究进展
WIF-1是Wnt/β-catenin信号通路的重要拮抗物之-.WIF-1作为-种抑癌基因,被发现在大多数肿瘤中表达降低,这与其启动子甲基化密切相关,而经去甲基化剂作用可恢复其表达.启动子甲基化导致的WIF-1抑癌作用的丧失可能主要通过异常激活Wnt/β-catenin信号通路而促进了肿瘤的发生.在不同肿瘤中,WIF-1表达降低与临床病理参数之间的关系有差异性.检测WIF-1表达及启动子甲基化水平可能为肿瘤早期诊断、治疗及判断预后提供帮助.
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肝癌细胞中WIF-1的甲基化状态分析
目的 探讨WIF-1基因在肝癌细胞中的甲基化状态及其与蛋白表达的关系,并初步研究了WIF-1与肝癌发生发展的关系.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)和测序方法分析了9种肝癌细胞系中WIF-1启动子区的甲基化状态,用RT-PCR检测了其mRNA的表达.用去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理肝癌细胞株并分析其mRNA和蛋白的表达的变化.结果 6种肝癌细胞中检测到异常的甲基化,甲基化率为66.7%.在用5-Aza-CdR处理细胞后,WIF-1表达缺失的肝癌细胞系不同程度地恢复了表达.MTT法分析发现WIF-1对SMMC-7721(7721)细胞生长有较为显著的抑制效果.结论 推断WIF-1启动子区频繁甲基化的现象可能是它在肝癌中表达沉默的主要机制,并在肝癌的发生发展起作用.
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肾细胞癌中Wif-1基因的甲基化状态及表达
目的 检测肾细胞癌(RCC)中Wnt抑制因子-1(Wif-1)基因的甲基化状态及表达水平,探讨其在肾细胞癌发生发展中的可能机制.方法 分别应用甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测56例肾细胞癌及相应癌旁正常肾组织中Wif-1基因的甲基化状态及表达水平.结果 Wif-1基因在RCC组织中的甲基化率显著高于相应癌旁正常肾组织(P<0.05).Wif-1基因在RCC组织中的相对表达量显著低于相应癌旁正常肾组织(P<0.05).在RCC组织中, Wif-1基因甲基化阳性组mRNA的相对表达量与甲基化阴性组mRNA的相对表达量比较无显著差异(P>0.05).结论 Wif-1基因启动子区的高甲基化在肾细胞癌的发生中是一个频发事件.
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DKK-3和WIF-1基因启动子甲基化状态与肝细胞癌的关系研究
目的 探讨DKK-3和WIF-1基因启动子甲基化状态与肝细胞癌发生的相关性.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应检测33例肝细胞癌及相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中DKK-3和WIF-1基因启动子甲基化状态,分析上述组织中两种基因甲基化状态与临床资料的关系.结果 DKK-3和WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于癌旁组织和正常组织(P＜0.05, P＜0.05), 而癌旁组织和正常组织中DKK-3和WIF-1基因甲基化率相比无明显差异;癌组织中DKK-3基因甲基化与临床资料中年龄及肝硬化有关;癌组织中WIF-1基因甲基化与临床资料中乙肝表面抗原、肝硬化有关.结论 DKK-3和WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生相关;DKK-3和WIF-1基因致肝细胞癌的发生机制可能与肝硬化致肝细胞癌的发生机制不尽相同,两者是否有相互作用尚不清楚.
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大肠癌中WIF-1和Wnt2b的表达及其临床意义
目的 过检测WIF-1与Wnt2b在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠癌中的表达及其与大肠癌生成、侵袭转移之间的关系,探讨WIF-1与Wnt2b之间的关系.方法 应用免疫组化SP法检测WIF-1和Wnt2b蛋白在15例癌旁正常组织、18例大肠腺瘤和103例大肠癌组织中的表达.结果 (1)WIF-1蛋白在大肠癌中的阳性率明显低于癌旁正常组织和腺瘤;Wnt2b蛋白在大肠癌中的阳性率高于癌旁正常组织和腺瘤.(2)WIF-1在大肠癌中的表达与患者的年龄、性别、分化程度、浸润程度、淋巴转移和远处转移均无关系(P>0.05);Wnt2b在大肠癌中的表达与大肠癌的分化程度、Dukes分期、淋巴结转移和远处器官转移相关(P<0.05),而与患者的年龄、性别均无关(P>0.05).(3)大肠癌中WIF-1与Wnt2b的表达呈负相关(r=-0.199,P<0.05).结论 WIF-1在正常大肠组织中呈阳性表达,在大肠癌的发病机制中可能发挥一定作用;Wnt2b的表达与大肠癌的发生、侵袭转移有关,联合检测WIF-1和Wnt2b有助于大肠癌的诊断、预防和治疗.
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肝细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及mRNA表达的研究
目的 探讨细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应和实时定量逆转录-聚合酶链反应技术,检测33例肝细胞癌及相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中WIF-1基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析上述组织WIF-1基因甲基化及mRN表达与临床资料的关系并分析甲基化对mRNA表达的影响.结果 WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于癌旁组织和正常组织(x2=4.89,P＜0.05),而癌旁组织和正常组织中WIF-1基因甲基化率相比无明显差异;癌组织中WIF-1基因甲基化与乙肝表面抗原、肝硬化有关;WIF-1基因mRNA表达量在三种组织中比较无明显差异.结论 WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生相关;WIF-1基因启动子甲基化与其mRNA表达的关系有待进一步研究.
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5-氮-2-脱氧胞苷调控 Wif-1基因甲基化对胆管癌细胞侵袭力的影响
目的：探讨甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷（DAC）对胆管癌细胞 TFK-1侵袭力的影响及其机制。方法采用 Transwell 法检测胆管癌细胞在不同浓度 DAC（0、10、20、40、80、160μmol·L－1）作用下侵袭力的变化；Western-blot 法检测 DAC 作用后 Wif-1蛋白的表达。结果DAC 对胆管癌细胞侵袭力有显著性抑制（P ＜0．05），且呈浓度依赖性；Wif-1蛋白在 TFK-1细胞中未见表达，DAC 处理后 Wif-1蛋白再现表达。结论DAC 对胆管癌TFK-1细胞的侵袭有抑制作用，此作用可能是由 Wif-1基因去甲基化来实现。
关键词： 5-氮-2-脱氧胞苷 WIF-1 胆管癌 侵袭力 -
sFRP、WIF-1、CD133、CD44在食管癌组织中的表达及其临床意义
目的：探讨sFRP、WIF-1、CD133、CD44在食管癌中的表达与临床病理特征之间的关系，为食管癌的研究提供新思路。方法选取2013年1月-2013年8月经手术切除的食管癌标本40例，术后病理均证实为食管癌患者，采用RT-PCR方法分析sFRP（分泌型卷曲相关蛋白）、WIF-1（Wnt抑制因子-1）、CD133（白细胞分化抗原分化群第133号）、CD44（白细胞分化抗原分化群第44号）的表达情况，应用SPSS 14.0统计软件进行数据分析，采用χ2检验统计方法。结果 sFRP、WIF-1、CD44、CD133基因在食管癌组织阳性表达率为32.50%，42.50%，60.00%，72.50%，在癌旁组织阳性表达率为65.00%，70.00%，37.50%，47.50%。 CD44、CD133基因在食管癌组织中表达水平高于癌旁组织（P<0.05），sFRP、WIF-1基因则在食管癌组织中表达水平低于癌旁组织（P<0.05），差异有统计学意义。结论sFRP、WIF-1在食管癌组织中表达低于癌旁组织，CD44、CD133在食管癌组织中表达高于癌旁组织。 sFRP、WIF-1基因低表达及CD44、CD133基因高表达可能与食管癌的发生、发展有关。
