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人慢性粒细胞白血病模型鼠的建立
通过SCID小鼠与NOD/Lt品系(T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞缺陷,循环补体缺乏,抗原呈递细胞分化及功能不良)回交得到的NOD/Ltsz-SCID/SCID小鼠(简称NOD/SCID小鼠).目前,NOD/SCID小鼠白血病模型的建立多采用经尾静脉接种较大数量的白血病细胞[1-3],虽然可以保证成功植入,但对研究小鼠的机体免疫反应实验十分不利,主要原因在于植入的肿瘤细胞不再分裂繁殖且小鼠本身为免疫缺陷鼠.
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人慢性粒细胞白血病bcr-abl基因反义寡核苷酸对K562细胞株的凋亡诱导作用研究
背景与目的：随着人类基因组计划的完成，人们的研究重点已转向基因功能的研究，反义核酸技术无疑为这项宏伟工程提供了一个新的发展方向。目前，国内关于反义寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的实验研究很少。本实验在体外构建针对人慢性粒细胞白血病(chronic myelogenou leukemia，CML)bcr-abl融合基因mRNA的反义寡核苷酸，探讨bcr-abl反义寡核苷酸对K562细胞凋亡的诱导作用。方法：以bcr-abl融合基因mRNA翻译起始点融合前区19个寡核苷酸为作用靶点，设计反义寡核苷酸，以其反义寡核苷酸序列转染人慢性粒细胞K562细胞，采用Hoechst染色法观察不同浓度寡核苷酸对K562细胞株的凋亡情况，采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测自噬凋亡蛋白LC3-Ⅱ的表达情况，采用流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞周期变化，采用JEM-4000EX电镜术检测细胞凋亡形态变化，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡情况。结果：Hoechst染色结果显示，bcr-abl反义寡核苷酸能显著促进K562细胞的凋亡，且呈现一定的浓度依赖性。Western blot检测结果显示，bcr-abl反义寡核苷酸各浓度组凋亡自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示，bcr-abl反义寡核苷酸作用于K562细胞后，细胞周期阻滞于G0/G1期。各组G0/G1期、S期细胞数量与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。在JEM-4000EX电镜下可见明显的新月型凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳显示，10、30μmol/mL bcr-abl反义寡核苷酸组可以明显观察到以180~200 bp碱基对整倍数出现明暗间隔的DNA梯状条带。结论：Bcr-abl反义寡核苷酸可显著诱导K562细胞凋亡，为临床上基因治疗人CML提供一定的参考。
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千层纸素诱导人慢性粒细胞白血病K562的凋亡作用
探讨千层纸素对人慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡诱导作用及其可能机制.采用MTT法检测细胞存活率;电镜下观察细胞超微结构的改变;DAPI染色观察细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法分析凋亡相关蛋白caspase9、survivin及ERK1/2的表达变化情况.结果表明千层纸素呈浓度依赖地抑制K562细胞的增殖作用,诱导K562细胞发生凋亡,上调K562细胞中cleaved-caspase 9蛋白,下调survivin、pro-caspase 9及p-ERK1/2蛋白的表达水平.千层纸素可诱导K562凋亡,这可能与下调survivin蛋白表达,激活caspase 9蛋白,抑制ERK信号通路有关.
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干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响
目的：肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶( eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株 K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon；采用细胞计数法测定细胞生长速率, MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平, Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株 K562相比, eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2．85±0．56)倍和(1．43±0．05)倍；而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。 K562/A02-sheno1细胞系与对照组 K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。 K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰 eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。
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转染CDX2-siRNA并加入人参皂苷Rh2培养的K562细胞增殖抑制率、凋亡率变化
目的：观察转染尾型同源盒基因（CDX2）siRNA并加入人参皂苷Rh2培养的人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖抑制率、凋亡率变化。方法将对数生长期的人慢性粒细胞白血病K562细胞，分为实验组和对照组，实验组包括A、B、C组，A组不转染，B、C组分别转染CDX2-siRNA和阴性对照序列（CDX2-siRNA-NC），然后实验组均加入60μmol／L的人参皂苷Rh2培养。对照组K562细胞常规培养。培养6、12、24、36、48 h采用MTT法测算各实验组细胞增殖抑制率；培养48 h采用Annexin Ⅴ-FITC／PI 双染法和流式细胞术测算各实验组细胞凋亡率。培养48 h时采用实时荧光定量PCR法检测各实验组细胞CDX2、Ph标记染色体或（和）BCR／ABL基因重排（BCR-ABL融合基因）mRNA，采用Western blotting法检测各组细胞CDX2、BCR-ABL融合蛋白。结果培养6、12、24、36、48 h时B组细胞增殖抑制率均高于A、C 组（P均＜0．05）。培养48 h时A、B、C 组的细胞凋亡率分别为26．50％±0．72％、73．20％±1．06％、32．00％±1．34％，B组细胞凋亡率均高于A、C组。培养48 h时，B组细胞CDX2、BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白相对表达量均低于A、C组，P均＜0．05。结论转染CDX2-siRNA并加入人参皂苷Rh2培养的人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖抑制率、凋亡率升高，这可能是转染CDX2-siRNA降低K562细胞CDX2表达，然后降低BCR-ABL融合基因表达导致的。
