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建立检测细胞色素P450酶与紫杉醇代谢相关突变位点的基因芯片分型方法
目的 建立针对与临床抗癌药物紫杉醇代谢相关的细胞色素P450(CYP450)酶基因多态性位点的快速、准确、高通量的基因芯片基因分型方法.方法 选取CYP450酶2C8*3、3A4* 18、3A5*3C等3个与紫杉醇代谢相关突变位点,根据基因库中报道的序列,设计每个基因多态性位点的野生型和突变型探针,在突变位点2侧设计PCR扩增引物,PCR片段长度应＜200 bp,并构建标准质粒.探针在3'端氨基修饰,下游引物标记荧光素Cy3,将探针按一定顺序点样于经醛基化处理的玻片制备成基因芯片.人体血液DNA样本分别通过3对引物扩增后与基因芯片上的探针杂交,通过扫描图像和配套软件对结果进行分析和判断.同时,对50份血液样本进行检测.结果 通过标准质粒杂交结果显示,每个位点对应的1对探针均能将野生型和突变型质粒进行准确地区分,无非特异性杂交信号出现;检测50份血液样本,CYP2C8 * 3位点的突变率为2%,CYP3A4 * 18位点均为野生型,CYP3A5 * 3C位点的突变率为62%.同时,通过测序法进行验证,基因芯片方法与测序方法的结果完全一致.结论 建立的同时检测抗癌药物紫杉醇代谢相关的CYP450酶基因多态性位点CYP2C8*3、CYP3A4 * 18、CYP3A5 * 3C的基因芯片分型方法快速、准确,结果可靠,重复性好,可用于指导紫杉醇患者的个体化用药,并为分析个体患者对于紫杉醇药物体内代谢提供了一个高通量技术平台.
关键词： 细胞色素P450酶系统 紫杉酚 多态现象 遗体 寡核苷酸序列分析 -
紫杉醇对培养的兔血管平滑肌细胞和内皮细胞增生与迁移的影响及其相互关系
目的观察不同浓度紫杉醇对兔血管平滑肌细胞和内皮细胞增生、迁移的影响及其相互关系.方法培养兔血管平滑肌细胞及内皮细胞,建立细胞共培养体系,模拟紫杉醇对血管壁平滑肌细胞及内皮细胞的作用方式,观察不同浓度紫杉醇对兔血管平滑肌细胞及内皮细胞DNA合成、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达的影响,测定不同浓度紫杉醇对兔血管平滑肌细胞及内皮细胞的迁移率,用直线回归法推算紫杉醇对平滑肌细胞及内皮细胞增生迁移的半数有效抑制浓度(IC50). 结果溶剂对照组平滑肌细胞及内皮细胞氚-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入、PCNA蛋白表达和迁移与对照组相比差异均无显著性.在1 nmol/L～1 μmol/L之间,紫杉醇呈浓度依赖地抑制平滑肌细胞3H-TdR掺入、PCNA蛋白表达和迁移(n=6, P<0.05);在10 nmol/L～1 μmol/L之间,紫杉醇呈浓度依赖地抑制内皮细胞3H-TdR掺入、PCNA蛋白表达和迁移(n=6, P<0.05);1 nmol/L的紫杉醇对内皮细胞3H-TdR掺入和PCNA蛋白表达有抑制倾向,但与对照组相比差异无显著性,而1 nmol/L的紫杉醇却显著抑制内皮细胞迁移(n=6, P<0.05).紫杉醇对兔血管平滑肌细胞增生、迁移抑制的IC50分别为(10.09±0.47)和(9.16±0.54 ) nmol/L,对内皮细胞增生、迁移抑制的IC50分别为(19.05±0.35)和(5.37±0.51 ) nmol/L. 结论一定浓度的紫杉醇在抑制兔血管平滑肌细胞增生迁移的同时可能会抑制内皮细胞增生迁移,延迟内皮再生.
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紫杉醇化疗后卵巢上皮性癌组织中COP9、JAK2、HSP、NADH基因表达的变化及其意义
目的 探讨卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇化疗后癌组织中COP9、JAK2、HSP、NADH基因表达的变化及其意义.方法 采用RT-PCR技术及实时定量PCR技术检测54份卵巢癌组织中JAK2、HSP、NADH和COP9基因的表达,并分析其临床意义.其中,接受紫杉醇化疗者33份(接受2～4、6～10个疗程化疗者分别为15、18份),未接受化疗者21份;病理分级:G1～G2 24份,G330份;病理类型:浆液性囊腺癌26份,黏液性囊腺癌21份,子宫内膜样腺癌7份;手术病理分期:Ⅲ期49份,Ⅳ期5份.结果 RT-PCR技术检测显示,COP9基因过度表达率化疗者为39%,明显低于未化疗者的95%(P<0.01);而JAK2、HSP、NADH基因过度表达率化疗者分别为91%、97%及94%,明显高于未化疗者的29%、48%及43%(P<0.05).除JAK2基因过度表达率在不同病理分级的癌组织中比较,差异有统计学意义(P<0.01)外,其他基因在不同病理分级、病理类型、手术病理分期及不同疗程化疗者间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).进一步行实时定量PCR技术检测显示,化疗者COP9、JAK2、HSP和NADH基因的拷贝数分别为568、7653、5766和3200,未化疗者分别为1886、3094、3341和1522,两者分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).除COP9基因的拷贝数在不同疗程化疗患者的癌组织中比较,差异无统计学意义(P>0.05)外,其他基因在不同疗程化疗、病理分级的癌组织中比较,差异均有统计学意义(P<0.05);上述4个基因拷贝数在不同病理类型间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).Ⅳ期患者癌组织中HSP、NADH基因拷贝数明显高于Ⅲ期(P值分别为<0.01、<0.05);但COP9及JAK2基因拷贝数在两者间比较,差异无统计学意义(P>0.05).JAK2、HSP、NADH基因表达3者间均呈明显正相关关系(r=0.56、0.44、0.57,P均<0.01);COP9与JAK2基因表达呈明显负相关关系(r=-0.48,P<0.01),但与HSP、NADH基因表达无明显相关性(r=-0.18、-0.06,P均>0.05).结论 COP9基因表达的下调和JAK2、HSP、NADH基因表达的上调可能与卵巢癌紫杉醇化疗耐药有一定的关系.
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顺铂和紫杉醇对人卵巢浆液性囊腺癌细胞系SKOV3ip 1多细胞团簇的耐药性实验研究
目的探讨人卵巢浆液性囊腺癌细胞系SKOV3ip1细胞形成的多细胞团簇(MCA)对顺铂和紫杉醇的敏感性及其可能机理.方法用液体重叠系统获得SKOV3ip1的MCA,以单层细胞为对照.分别加入浓度为0.8、8.0、40.0、80.0 μmol/L的顺铂或浓度为0.2、2.0、10.0、20.0 μmol/L的紫杉醇作用后,采用台盼蓝排除实验检测MCA细胞抑制率、体外耐药的克隆形成率实验检测MCA的克隆形成率、流式细胞仪分析检测MCA的细胞周期分布和细胞凋亡率.结果不同浓度的顺铂(0.8、8.0、40.0、80.0μmol/L)或紫杉醇(0.2、2.0、10.0、20.0 μmol/L)作用后,MCA细胞抑制率明显低于单层细胞,差异有显著性(P顺铂=0.045,P紫杉醇＝0.003).顺铂(40μmol/L)作用12 h后的MCA和单层细胞均无细胞克隆(≥50个活细胞组成的细胞团为1个细胞克隆)形成,紫杉醇(10μmol/L)作用12 h后的MCA(n=100)的克隆形成率为7%,明显高于单层细胞的0%(P＜0.05).空白对照中,MCA的G0+G1期细胞较单层细胞明显增多(P=0.003);顺铂作用后MCA和单层细胞的细胞凋亡率分别为(1.898±0.562)%和(7.930±5.541)%,两者比较,差异无显著性(P＝0.100),细胞周期分布也无明显变化;紫杉醇作用后MCA的细胞凋亡率(5.510±2.517)%,与单层细胞的(10.098±2.416)%比较,差异有显著性(P＝0.012),紫杉醇在单层细胞中诱导的G2+M期细胞阻滞在MCA中出现缺失.结论SKOV3ipl的MCA对顺铂和紫杉醇化学治疗(化疗)呈现出不同程度的耐药性,尤其对紫杉醇耐药性更为明显.细胞周期分布的变化、G2+M期细胞阻滞的缺失及MCA的细胞凋亡率的降低,可能是引起MCA对紫杉醇化疗耐药的原因.
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卵巢癌细胞系CAOV3体外化疗后survivin mRNA表达的变化
目的探讨卵巢癌细胞系CAOV3体外化疗后survivin mRNA 表达的变化.方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度(分别为2000、200、20、2、0.2 mg/L)紫杉醇或卡铂对CAOV3细胞体外生长的抑制作用.应用RT-PCR技术检测高浓度紫杉醇或卡铂(分别为200 、500 mg/L)处理1 d,低浓度紫杉醇或卡铂(分别为20 、50 mg/L)处理1、3、5 d后存活的卵巢癌细胞中survivin mRNA的表达水平,同时利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果不同浓度(分别为2000、200、20、2、0.2 mg/L)紫杉醇或卡铂作用后CAOV3细胞的抑制率分别为94%、88%、34%、22%、13%或97%、46%、14%、9%、7%,随着药物浓度的下降,细胞受抑制程度明显减弱(P＜0.05).低浓度紫杉醇处理1、3、5 d后CAOV3细胞的凋亡率分别为15%、23%和29%;高浓度紫杉醇处理1 d后CAOV3细胞的凋亡率为43%.低浓度卡铂处理1、3、5 d后CAOV3细胞的凋亡率分别为14%、22%和26%;高浓度卡铂处理1 d后CAOV3细胞的凋亡率为19%.紫杉醇或卡铂低浓度处理3 d及高浓度处理1 d后存活的卵巢癌细胞中survivin mRNA的表达量均明显高于未加药的对照(P<0.01),尤其是紫杉醇处理后存活的卵巢癌细胞中survivin mRNA的表达量增加更为明显(P<0.01).结论survivin基因可能在卵巢癌细胞系CAOV3体外化疗中起抑制作用.
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短发夹状RNA对卵巢癌细胞survivin mRNA表达及紫杉醇药物敏感性的影响
目的观察表达短发夹状RNA(shRNA)的mU6/survivin质粒转染卵巢癌细胞株OVCAR3细胞后,对OVCAR3细胞survivin mRNA表达的抑制作用,以及对OVCAR3细胞紫杉醇药物敏感性的影响.方法将表达绿色荧光蛋白的pEGFPC2质粒与脂质体按不同比例转染OVCAR3细胞,流式细胞仪检测其转染效率.根据转染效率高时pEGFPC2质粒与脂质体的比例,将mU6/survivin质粒转染入OVCAR3细胞.实验分为3组:未转染组、脂质体组、转染组,RT-PCR技术检测3组OVCAR3细胞中survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组OVCAR3细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50).结果 pEGFPC2质粒与脂质体按1∶ 2比例转染OVCAR3细胞时其转染效率高,达23.6%.将mU6/survivin质粒与脂质体也按1∶ 2比例转染OVCAR3细胞24 h后,未转染组、脂质体组、转染组细胞survivin mRNA的相对含量分别为0.81±0.05、0.79±0.12、0.26±0.04,转染组survivin mRNA相对含量下降至未转染组的32%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01).转染组转染24 h后,细胞凋亡率为(31.9±1.2)%,明显高于未转染组的(4.9±0.7)%和脂质体组的(5.6±0.5)%(P=0.000);转染组细胞周期被阻滞于G0/G1期,G2/M期减少,分别与未转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01).MTT比色法检测结果显示,未转染组、脂质体组、转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50分别为(0.305±0.032)、(0.157±0.031)、(0.019±0.001)μmol/L,转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50降低为未转染组的1/16,两组比较,差异有统计学意义(P=0.000).结论 shRNA可有效抑制卵巢癌细胞survivin mRNA的表达,并显著提高了卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性.
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化学药物对卵巢恶性肿瘤患者血糖代谢的影响
目的探讨化学药物对卵巢恶性肿瘤患者血糖代谢的影响.方法收集1997年1月～2001年12月收治的卵巢恶性肿瘤患者375例化学药物治疗(化疗)前后的血糖检验报告及相关临床资料,并对其进行回顾性分析.结果 375例患者中,化疗前合并糖尿病9例,其余化疗前血糖水平正常.化疗后空腹血糖升高32例,占8.5%.32例中明确诊断为糖尿病14例,糖耐量低减9例,一过性血糖升高9例,分别占同期接受化疗的卵巢恶性肿瘤患者的3.7%、2.4%和2.4%.其中,接受以紫杉醇类药物为主的化疗患者208例,发生血糖异常23例,占同类化疗11.1%(23/208),占同期化疗6.1%(23/375);接受以铂类药物为主的化疗患者141例,发生血糖异常8例,占同类化疗5.7%(8/141),占同期化疗2.1%(8/375);接受其他化疗方案患者26例,发生血糖异常1例,占同期化疗0.3%(1/375).以紫杉醇类为主化疗与以铂类为主化疗引起的血糖异常的发生率相比较,差异有显著性(P＜0.05).化疗诱发的血糖异常多数发生在化疗后1～3个疗程.结论卵巢恶性肿瘤患者接受化疗后可能会出现血糖异常,甚至发生糖耐量低减或糖尿病,以紫杉醇类为主的化疗方案治疗中这种情况更加常见,且多发生于治疗的第1～3个疗程,对此应予以重视.
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蛋白酶体抑制剂联合紫杉醇对卵巢上皮性癌细胞药物敏感性的影响
目的 研究蛋白酶体抑制剂波替单抗与紫杉醇单独作用及联合作用于卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞株SKOV3的效果,并对其诱导细胞凋亡的分子机制进行探讨.方法 波替单抗与紫杉醇单独或联合(50 nmol/L波替单抗、90 nmol/L紫衫醇或50 nmol/L波替单抗+90 nmol/L紫衫醇)作用于SKOV3细胞后,四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞增殖活性并计算细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(AKT)和磷酸化糖原合成酶激酶3β(CSK-3β)蛋白的表达水平.结果 波替单抗与紫衫醇联合作用于SKOV3细胞,12、24、36、48及72 h各时间点的细胞存活率分别为(65.2±5.8)%、(58.3±14.4)%、(35.3±5.0)%、(19.2±1.5)%和(11.4±2.5)%,与单用紫杉醇比较,细胞增殖抑制效果增强,各时间点分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).单用紫杉醇、单用波替单抗和两者联用的细胞凋亡率分别为(14.7±0.5)%、(15.1±0.8)%和(20.5±0.7)%,波替单抗与紫杉醇联用的细胞凋亡率明显增高,分别与单用紫杉醇或单用波替单抗比较,差异均有统计学意义(P<0.05).不同药物处理细胞后,磷酸化AKT和磷酸化GSK-3β蛋白的表达水平均有不同程度降低,以波替单抗与紫杉醇联用者降低为明显[分别为(3.2±0.8)%、(19.3±0.4)%],分别与单用紫杉醇、单用波替单抗、正常未处理细胞比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 蛋白酶体抑制剂波替单抗与紫杉醇联用能增强卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性;AKT/GSK-3β信号通路可能在波替单抗与紫杉醇联用诱导细胞凋亡中发挥了重要作用.
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沉默hMSH2基因表达对紫杉醇耐药的卵巢上皮性癌OC3/TAX300细胞耐药性的影响
目的 应用RNA干扰(RNAi)技术沉默hMSH2基因后,观察其对紫杉醇耐药的卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞系OC3/TAX300细胞耐药性的影响.方法 设计靶向沉默耐药基因hMSH2的小分子干扰RNA(siRNA)序列,转染OC3/TAX300细胞(实验组),以转染随机无关序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组.(1)采用实时定量逆转录(RT)-PCR技术和蛋白印迹法分别检测3组细胞中hMSH2 mRNA和蛋白的表达.(2)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测紫杉醇(2 μg/ml,下同)作用12、24、48、72 h后3组细胞的增殖能力(以细胞生长抑制率表示),流式细胞术检测紫杉醇作用24、48 h后3组细胞的细胞凋亡率和细胞周期比例,透射电镜观察紫杉醇作用48 h后3组细胞的形态学改变.结果 (1)实验组细胞中hMSH2mRNA的相对表达水平为0.004±0.000,低于阴性对照组的0.053±0.006和空白对照组的0.057±0.012(P＜0.05);hMSH2蛋白的相对表达水平为0.19±0.04,低于阴性对照组的1.00±0.07和空白对照组的0.95±0.03(P ＜0.05).(2)紫杉醇作用24、48、72 h后,实验组细胞生长抑制率均明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);紫杉醇作用24、48 h后,实验组细胞的凋亡率和G2/M期细胞比例均明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);而阴性对照组细胞的生长抑制率、凋亡率、G2/M期细胞比例分别与空白对照组,差异均无统计学意义(P＞0.05).透射电镜下观察,紫杉醇作用48 h后,实验组大多数细胞可见细胞固缩,部分出现核碎裂和凋亡小体,核仁消失,线粒体明显肿胀,胞质内可见大量空泡状结构;而阴性对照组和空白对照组大多数细胞形态较规则,细胞核位于细胞中央,核仁清晰,线粒体轻度肿胀.结论 RNAi技术沉默紫杉醇耐药的卵巢癌细胞系OC3/TAX300细胞中hMSH2基因的表达后,可逆转OC3/TAX300细胞对紫杉醇的耐药性.
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肝素结合表皮生长因子抑制剂对卵巢上皮性癌紫杉醇耐药的逆转作用及其机制
目的 探讨肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)抑制剂CRM197对卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇耐药的逆转作用及可能机制.方法 (1)四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测CRM197作用后卵巢癌紫杉醇耐药细胞系A2780/Taxol细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50);蛋白印迹法及实时PCR技术分别检测CRM197作用后A2780/Taxol细胞中HB-EGF、表皮生长因子受体(EGFR)、P糖蛋白(P-gp)蛋白及多药耐药基因(MDR1)mRNA的表达.(2)构建MDR1小分子RNA(siRNA)质粒并转染A2780/Taxol细胞,实验分为4组,即空载体组、MDR1 siRNA组、空载体+CRM197组、MDR1 siRNA+CRM197组,检测4组A2780/Taxol细胞中P-gp功能[以P-gp的底物若丹明123(Rh123)的荧光强度表示]和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白活性[以4硝基苯胺(pNA)浓度表示].(3)建立卵巢癌A2780/Taxol细胞的裸鼠移植瘤模型,免疫组化SP法检测CRM197作用后裸鼠移植瘤组织中EGFR和P-gp蛋白的表达.结果 (1)MTT比色法检测显示,CRM197作用后A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50为(6.4±0.3)μmol/L,明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞[(34.1±0.5)μmol/L;P<0.01],CRM197对紫杉醇的耐药逆转倍数为5.3.蛋白印迹法检测显示,CRM197作用后A2780/Taxol细胞中HB-EGF、EGFR、P-gp蛋白的表达水平(分别为1.44±0.29、0.71±0.25、0.82±0.19)均明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞(分别为2.72±0.32、1.87±0.31、1.84±0.27,P均<0.05);实时PCR技术检测显示,CRM197作用后A2780/Taxol细胞中MDR1 mRNA的表达水平(0.79±0.13)也明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞(1.78±0.27,P<0.05).(2)空载体组、MDR1 siRNA组、空载体+CRM197组、MDR1 siRNA+CRM197组A2780/Taxol细胞中的Rh123平均荧光强度分别为33.4±1.6、56.3±3.3、43.5±3.1、100.4±7.4,细胞中pNA浓度分别为(11.4±1.2)、(52.8±0.9)、(71.2±3.6)、(82.7±3.8)μmol/L,上述指标均为MDR1 siRNA+CRM197组高于空载体+CRM197组,空载体+CRM197组、MDR1 siRNA组均高于空载体组,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)免疫组化SP法检测显示,CRM197作用后的A2780/Taxol细胞裸鼠移植瘤组织中EGFR、P-gp蛋白的表达水平分别为(4.4±1.4)、(3.8±1.1)分,明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞裸鼠移植瘤组织[分别为(10.2±3.1)、(8.8±2.7)分,P<0.05].结论 HB-EGF抑制剂CRM197可逆转卵巢癌紫杉醇耐药,其作用机制可能与CRM197抑制EGFR/MDR1/P-gp通路、增加caspase-3活性,从而促进耐药细胞凋亡相关.
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肝素结合表皮生长因子在紫杉醇耐药卵巢上皮性癌细胞和组织中的表达及意义
目的：检测肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）在紫杉醇耐药卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞和组织中的表达水平，并探讨HB-EGF与卵巢癌紫杉醇耐药性的关系。方法（1）体外实验：蛋白印迹法检测卵巢癌细胞株A2780（紫杉醇敏感）和A2780/Taxol（紫杉醇耐药）细胞中HB-EGF蛋白的表达。体外细胞实验分为4组，A2780+CRM197组、A2780/Taxol+CRM197组、A2780组、A2780/Taxol组，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测4组细胞的增殖能力[以吸光度（A）值表示]，流式细胞仪检测4组细胞的细胞周期比例，酶标仪检测4组细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的活性[以4硝基苯胺（pNa）浓度表示]。（2）体内实验：将A2780和A2780/Taxol细胞分别接种于裸鼠腋下，建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型；免疫组化SP法检测裸鼠移植瘤组织中HB-EGF蛋白的表达。体内动物实验分为4组，方法同体外细胞实验分组，每组5只裸鼠，观察4组裸鼠移植瘤的生长情况，并计算抑瘤率。结果（1）体外实验结果：A2780/Taxol细胞中HB-EGF蛋白的表达水平为2.11±0.41，明显高于A2780细胞的0.75±0.20（P<0.01）。A2780+CRM197组、A2780/Taxol+CRM197组细胞增殖的抑制作用随CRM197浓度的增加而增强，呈明显的浓度依赖性（P<0.01），且当CRM197浓度≥1μg/ml时，A2780/Taxol+CRM197组细胞增殖的抑制作用明显高于A2780+CRM197组细胞（P<0.05）；A2780+CRM197组细胞G0/G1期比例[（67±4）%]高于A2780组[（54±6）%]，A2780/Taxol+CRM197组细胞G0/G1期比例[（72±4）%]高于A2780/Taxol组[（24±8）%]，分别比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；A2780+CRM197组细胞中pNa浓度[（40±6）μmol/L，即caspase-3蛋白活性]高于A2780组[（6±6）μmol/L]，A2780/Taxol+CRM197组细胞中pNa浓度[（66±12）μmol/L]高于A2780/Taxol组[（9±6）μmol/L]，分别比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。（2）体内实验结果：接种A2780和A2780/Taxol细胞的裸鼠移植瘤组织中HB-EGF蛋白的表达水平分别为（5.0±2.2）、（10.8±3.3）分，两者比较，差异有统计学意义（P<0.01）。A2780/Taxol+CRM197组肿瘤体积和肿瘤质量分别为（546±85）mm3和（0.56±0.09）g，明显低于A2780/Taxol组的（1840±145）mm3和（1.76±0.23）g，A2780+CRM197组肿瘤体积和肿瘤质量分别为（818±63）mm3和（0.74±0.15）g，明显低于A2780组的（1355±119）mm3和（1.31±0.27）g，分别比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。A2780/Taxol+CRM197组的抑瘤率为68%，高于A2780+CRM197组的43%；A2780/Taxol+CRM197组的抑瘤率为68%，高于A2780+CRM197组的43%，分别比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论紫杉醇耐药的卵巢癌细胞和组织中HB-EGF蛋白均高表达，与卵巢癌对紫杉醇的耐药性相关。抑制HB-EGF蛋白的表达可有效促进紫杉醇耐药卵巢癌细胞凋亡，抑制其生长。
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微小RNA 27a在卵巢上皮性癌紫杉醇耐药细胞中的表达及其与耐药的关系
目的 研究微小RNA 27a(miR-27a)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇耐药细胞中的表达及其与耐药的关系.方法 采用实时PCR技术检测卵巢癌A2780细胞及其紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol中miR-27a的表达水平.利用脂质体lipofectamine 2000将成熟miR-27a的模拟物、阻遏物及阴性对照(NC)转染A2780和A2780/Taxol细胞,实时PCR技术检测转染细胞中MDRI基因mRNA的表达;蛋白印迹法检测转染细胞中P-糖蛋白(P-gp)和同源结构域相关的蛋白激酶2(HIPK2)蛋白的表达;采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪分别检测紫杉醇作用于转染后细胞的增殖情况及细胞凋亡率.结果 (1)miR-27a在A2780/Taxol细胞中高表达,与A2780细胞相比表达水平增高2.2倍,差异有统计学意义(P<0.05).(2)转染miR-27a阻遏物后,A2780/Taxol细胞中MDR1 mRNA的表达水平为0.61±0.14,与转染NC细胞(表达水平为1.00)比较下降39%,差异有统计学意义(P<0.05);P-gp印蛋白的表达水平为(26±5)%,HIPK2蛋白的表达水平为(30±6)%,分别与转染NC细胞的P-gp蛋白[(43±7)%]和HIPK2蛋白[(19±4)%]的表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性增加,半数抑制浓度(IC50)为0.5 μmol/L,与转染NC细胞(IC50为6.8 μmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率明显升高,达(32.5±3.6)%,与转染NC细胞的凋亡率(5.6±2.1)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)转染miR-27a模拟物后,A2780细胞中MDR1 mRNA的表达水平为2.21±0.11,与转染NC细胞(表达水平为1.00)比较升高121%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miR-27a在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中高表达,其町能通过调控靶基因HIPK2,间接调节MDB1及P-gp的表达和功能而参与耐药.
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MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究
目的 研究多药耐药基因--MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞A2780/taxol对紫杉醇耐药的作用.方法 用真核质粒介导的针对MDR1及MDR3基因的短发夹状RNA(shRNA)转染A2780/taxol细胞(分别为MDR1组、MDR3组),空质粒转染作为对照(空载体组).流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123(Rh123)积聚情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)检测细胞晚期凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50),RT-PCR技术检测MDR1及MDR3 mRNA的表达,蛋白印迹法(western blot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白的表达.结果 转染后,MDR1组及MDR3组A2780/taxol细胞的早期凋亡率分别达(20.21±0.56)%和(10.87±1.24)%.MDR1、MDR3组A2780/taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116.6±8.1、98.4±3.8,显著高于空载体组的40.2±1.6,差异有统计学意义(P＜0.05).TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡.MDR1、MDR3组A2780/taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降,分别与空载体组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).转染48 h后,A2780/taxol细胞中MDR1和MDR3 mRNA的表达水平分别下降了(73.3±0.8)%和(51.6±0.4)%;MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为(80.8±2.6)%、(72.0±4.7)%,均较空载体组增加.结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780/taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡,从而逆转A2780/taxol细胞对紫杉醇的耐药性.
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去势抵抗性前列腺癌冷冻消融联合多西紫杉醇治疗临床观察
目的:评价氩氦刀冷冻消融联合多西紫杉醇化疗治疗去势抵抗性前列腺癌的安全性、有效性及临床价值.方法:2007-06-01-2011-12-30南京大学医学院附属鼓楼医院采用冷冻消融联合多西紫杉醇+泼尼松3周标准方案化疗治疗去势抵抗性前列腺癌17例.以PSA缓解,前列腺MR及ECT骨扫描作为评定指标,疗效评价包括完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、病情稳定(SD)和病情恶化(PD).不良反应选择髓抑制、肝功能损害及呕吐作为评估.结果:17例患者经过18～66个月随访,平均随访时间31个月.冷冻手术时间(102±43) min,均未输血及术中并发症.其中29.4％(5/17) CR,47.1％(8/17) PR,17.6％(3/17) SD,5.9％(1/17) PD.CR+PR患者的PSA进展时间为18～112周,中位进展时间为54.2周.中位生存期＞14个月.PSA无进展生存率为94.1％.合并骨痛患者11例,经治疗后72.7％(8/11)骨痛缓解,27.3％(3/11)骨痛稳定.骨髓抑制、肝功能损害和胃肠道反应等不良反应可耐受.结论:冷冻消融联合标准多西紫杉醇+泼尼松标准方案化疗治疗CRPC安全可行,近期疗效明显,远期疗效有待进一步观察.
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一线应用紫杉醇联合萘达铂治疗晚期食管癌近期疗效观察
目的:观察紫杉醇联合萘达铂方案一线治疗晚期或手术/放疗后转移复发性食管癌患者的近期疗效和安全性.方法:给药方案为紫杉醇135～150 mg/㎡,3 h静脉滴入,d1;萘达铂80 mg/㎡,2 h静脉滴入,d2.每个周期为21 d.疗效评估用RECIST疗效评价标准;不良反应评估用NCI CTC 3.0标准.结果:有效率(RR)50.0%(14/28),稳定率(SD)35.7%(10/28),进展率(PD)14.3%(4/28).主要不良反应有粒细胞细胞下降78.6%(3/4度21.4%),贫血57.1%(3/4度10.7%),血小板下降50.0%(3/4度10.7%),恶心60.7%(3/4度7.1%),呕吐50.0%(3/4度3.6%),2例(7.1%)患者推迟化疗但均≤1周,无治疗相关性死亡.结论:紫杉醇联合萘达铂治疗晚期或手术/放疗后转移复发性食管癌具有较好的疗效且有较好的耐受性.
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培美曲塞二钠与多西紫杉醇单药治疗晚期非小细胞肺癌的对比研究
目的:比较培美曲塞二钠和多西紫杉醇对一线化疗失败的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的疗效与不良反应.方法:84例一线化疗失败或不能耐受的晚期NSCLC患者随机分为培美曲塞二钠组(44例)和多西紫杉醇组(40例),分别接受培美曲塞二钠500 mg/㎡治疗和多西紫杉醇75 mg/㎡治疗.入选患者均接受2～6个周期化疗.结果:所有患者参与评价,单用培美曲塞二钠组及单用多西紫杉醇组的有效率分别是13.6%(6/44)和10.0%(4/40);疾病控制率分别是54.5%(24/44)和55.0%(22/40),两组的差异均无统计学意义,x2=0.002,P值分别为0.741和0.967.单用培美曲塞二钠组和多西紫杉醇组患者的中位生存时间分别为8.2和8.1个月,1年生存率分别为27.3%和25.0%,两组的差异均无统计学意义,P值分别为0.258和0.580.两组的不良反应均为骨髓抑制、恶心、呕吐、乏力及脱发.培美曲塞二钠组发生中性粒细胞减少的概率明显低于多西紫杉醇组,Ⅰ～Ⅱ度分别为31.8%(14/44)和65.0%(26/40),x2=9.249,P=0.002;Ⅲ～Ⅳ度分别为4.5%(2/44)和30.0%(12/40),x2=9.775,P=0.002.结论:对于一线化疗失败或不能耐受的晚期NSCLC患者,分别使用培美曲塞二钠和多西紫杉醇进行化疗,疗效相似,但使用培美曲塞二钠化疗的不良反应更低,值得临床推广使用.
关键词： 癌 非小细胞肺/药物疗法 谷氨酸盐类 紫杉酚 抗肿瘤药 -
紫杉醇联合顺铂及氟尿嘧啶方案治疗晚期转移性胃癌的临床观察
目的:研究紫杉醇(PTX)对比多西他赛(TXT)联合顺铂(DDP)、氟尿嘧啶(5-FU)一线治疗晚期转移性胃癌的近期疗效和不良反应.方法:将48例晚期转移性胃癌患者分为治疗组和对照组.治疗组(n=23)采用PCF(PTX 160 mg/㎡,静脉滴入,d1;DDP 60 mg/㎡,静脉滴入,d1;5-FU 2.5 g/㎡,用便携微量泵静脉持续滴入48 h)方案;对照组(n=25)采用DCF(TXT 70 mg/㎡,静脉滴入,d1;DDP60 mg/㎡,静脉滴入,d1;5-FU 2.5 g/㎡,用便携微量泵静脉持续滴入48 h)方案化疗.至少完成2个周期化疗后评价两组有效率(RR)、疾病控制率(DCR)及不良反应.结果:两组均可评价疗效.治疗组RR为52.2%,DCR为82.6%;对照组RR为48.0%.DCR为80.0%.两组比较差异均无统计学意义,P值均>0.05.治疗组与对照组主要不良反应有粒细胞减少、脱发、恶心呕吐和过敏反应等.两组不良反应比较,3～4级粒细胞减少差异有统计学意义,P<0.05.结论:PCF方案治疗晚期转移性胃癌疗效与DCF方案相似,不良反应PCF方案优于DCF方案,值得进一步研究.
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三周小剂量多西紫杉醇治疗老年激素难治性晚期前列腺癌的临床研究
目的:初步研究3周小剂量多西紫杉醇单药治疗老年激素难治性晚期前列腺癌的疗效并探讨其毒副反应.方法:入选老年激素难治性晚期前列腺癌患者共18例,多西紫杉醇50 mg/m2,静脉滴入,d1;泼尼松5 mg,口服,d1～d212次/d,21 d为1个周期.完成4个周期后评价疗效.结果:化疗结束后,6例患者的血PSA值降至正常水平,6例PSA值下降＞50%,2例PSA值变化不明显,有效率为66.67%.本组随访2～17个月,中位生存期为12.75个月,疾病进展时间为2个月,1年生存率为33.33%(6/18).不良反应可耐受.结论:3周小剂量多西紫杉醇单药治疗老年激素难治性晚期前列腺癌有效率较高,毒副反应轻,耐受性好,并可以改善疾病相关症状,提高生存质量.
关键词： 前列腺肿瘤/药物疗法 紫杉酚 难治病 激素类 治疗结果 -
乳腺癌相关生物学指标对紫杉类药物治疗晚期乳腺癌疗效预测作用分析
目的:回顾性研究雌激素受体(ER)、p53、bcl-2和mdr-1对乳腺癌应用紫杉类药物化疗疗效的预测作用.方法:182例晚期乳腺癌患者应用紫杉类化疗,其中单药紫杉醇组37例,单药泰索帝组22例,紫杉醇联合组78例,泰索帝联合组45例.应用免疫组化的方法对所有患者的ER、p53、bcl-2和mdr-1生物学指标在蛋白水平进行检测.结果:KPS评分、解救情况以及既往蒽环类及转移部位多少对紫杉类药物疗效均无预测作用.ER阳性患者有效率为33.01%(34/103),ER阴性患者有效率为50.63%(40/79),两组相比差异有统计学意义,x2=5.755,P=0.022;而p53、bcl-2、mdr-1等阳性组与阴性组有效率之间相比,差异无统计学意义(p53 x2=0.004,P=0.950;bcl-2 x2=0.651,P=0.451;mdr-1 x2=0.177,P=0.751;).多因素分析显示,ER阳性差异仍有统计学意义,P=0.027.而KPS评分、既往应用蒽环类药物、转移部位数目、差异均无统计学意义.结论:ER阴性对紫杉类药物的疗效可能有预测作用,而p53、bcl-2和mdr-1对紫杉类药物无预测作用.
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蛋白tau表达与乳腺癌紫杉类新辅助化疗敏感性的关系
目的:探讨原发性乳腺癌组织中tau蛋白的表达与乳腺癌紫杉类药物新辅助化疗敏感性的关系.方法:应用免疫组化法对113例原发性乳腺癌患者术前穿刺样本进行tau蛋白表达水平的检测,分析其与紫杉类药物化疗敏感性的关系.结果:乳腺癌组织中tau蛋白表达的阳性率为24.78%(28/113);紫杉类药物新辅助化疗后,达到病理完全缓解(pCR)的患者40例,存在残留癌的患者73例.pCR组tau蛋白阳性率为12.50%(5/40),残留癌组tau蛋白阳性率为31.51%(23/73),两者之间差异有统计学意义,χ2=5.008,P=0.025.结论:tau蛋白表达水平与乳腺癌紫杉类药物化疗敏感性呈负相关,检测tau蛋白表达状态对预测乳腺癌紫杉类药物新辅助化疗的敏感性可能具有一定的指导意义.
