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EphA2在不同肝癌细胞系中过表达及其与乙肝病毒感染相关
目的 观察EphA2在不同肝癌细胞系中的表达及与乙肝病毒(HBV)感染的相关性.方法 体外培养正常人肝细胞系HL7702及HepG2和HepG2.2.15两种肝癌细胞系,用免疫化学染色及蛋白免疫印迹法,检测EphA2蛋白的表达,用流式细胞术检测细胞的增殖指数与凋亡率,分析EphA2表达与肝细胞凋亡、增殖的关系.通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测肝癌细胞中HBV DNA的水平,分析EphA2表达与HBV感染的相关性.结果 与正常肝细胞比较,两种肝癌细胞中EphA2蛋白表达均明显增强(P＜0.05),且HepG2.2.15细胞中EphA2的表达水平显著高于HepG2细胞中EphA2的表达水平(P＜0.01);与正常肝细胞比较,两种肝癌细胞的增殖指数升高、细胞凋亡率降低(P＜0.01),且肝细胞的增殖、凋亡与EphA2表达具有明显相关性(P＜0.01).HepG2.2.15细胞中HBVDNA水平显著高于HepG2细胞中HBV DNA水平,且HBV DNA水平与EphA2表达呈显著正相关(r=0.878,P＜0.05).结论 EphA2在肝癌细胞中过表达,可促进肝细胞的恶性生长,抑制肝细胞的凋亡,且EphA2过表达与HBV感染密切相关.
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miR-141通过靶向下调EphA2表达而抑制人口腔鳞状细胞癌细胞系的增殖
目的：探讨miR-141对口腔鳞状细胞癌（ OSCC） CAL27细胞增殖活性的影响及其与EphA2的靶向关系。方法构建pre-miR-141、EphA2野生型（EphA2-WT）和突变型（EphA2-MT）真核表达载体，采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测pre-miR-141的转染效率。用MTT检测细胞增殖活性，用双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR和Western blot验证miR-141与EphA2的靶向关系。结果 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-141、pmirGLO-EphA2-WT和pmirGLO-E-phA2-MT表达载体构建成功，转染pre-miR-141的CAL27细胞miR-141的表达显著升高（ P＜0.001）。 miR-141过表达能够明显抑制CAL27细胞的增殖（ P＜0.05），共转染pre-miR-141和EphA2-WT的CAL 27细胞其荧光活性显著下降（P＜0.001），转染pre-miR-141的CAL27细胞其EphA2的表达要显著低于转染空质粒组（P＜0.001），miR-141的过表达能够显著抑制EphA2的蛋白表达水平。结论 miR-141的过表达可能通过靶向下调EphA2的表达从而抑制OSCC的增殖。
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乙肝病毒促进肝癌细胞系的转移侵袭力
目的 探讨乙肝病毒(HBV)对肝癌细胞转移能力的影响及其可能机制.方法 以初始汇合度为30％,将3种细胞系HL-7702(人正常肝细胞系)、HepG2(未转染HBV-DNA的人肝癌细胞系)、HepG2.2.15(稳定转染HBV-DNA的人肝癌细胞系)种植于96孔板中,待细胞增殖至70％汇合时,利用划痕器制造划痕伤口,置于活细胞动态成像系统中进行多时间点的显微拍照与数据采集,计算相对伤口密度(RWD),并通过免疫荧光染色与Western blot技术测定细胞中EphA2蛋白表达,分析其与RWD值的相关性.结果 细胞迁移实验中,划痕后24～96 h,HL-7702组RWD显著高于HepG2与HepG2.2.15组(P＜0.01),划痕后72 ～ 144 h,HepG2.2.15组RWD显著高于HepG2组(P＜0.01);细胞侵袭实验中,HL-7702细胞因不能穿过基质胶,而无RWD值;划痕后72～144 h,HepG2.2.15组RWD显著高于HepG2组(P＜0.05或P＜0.01).EphA2表达:与HL-7702组比较,HepG2与HepG2.2.15组细胞中EphA2表达水平显著升高(P＜0.01),其中HepG2.2.15组中EphA2表达水平显著高于HepG2组(P＜0.01),且两组肝癌细胞中EphA2的表达量与划痕实验的RWD值呈显著正相关(迁移实验:P＜0.01;侵袭实验:P＜0.01).结论 乙肝病毒可能促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与上调EphA2的异常表达有关.
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乳腺癌组织中EphA2、SIAH2、β-catenin的表达量及其与肿瘤恶性程度的相关性
目的：分析乳腺癌组织中EphA2、SIAH2、β-catenin的表达量及其与肿瘤恶性程度的相关性。方法将2012年8月至2015年12月间接受乳腺肿瘤切除治疗的患者128例作为研究对象，根据肿瘤的良恶性不同分为乳腺癌组54例，乳腺腺瘤组74例。将手术切除的肿瘤组织碾磨成匀浆，并应用Western-blot蛋白表达检测及酶联免疫吸附法（ ELISA）血清学检测，对比两组患者的肿瘤组织EphA2、SIAH2、β-catenin表达，肿瘤组织增殖相关指标，血清侵袭转移相关指标等水平差异，并进一步分析肿瘤组织EphA2、SIAH2、β-catenin表达与恶性程度的相关性。结果乳腺癌组患者的肿瘤组织EphA2、SIAH2、β-catenin表达量均显著高于乳腺腺瘤组患者（ P ﹤0.05）；乳腺癌组患者的肿瘤黑素瘤抗原（MAGE）-A11、FOXM1、细胞增殖抗原标记物（Ki67）、细胞周期素D1（Cyclin D1）表达量高于乳腺腺瘤组患者，E-cadherin表达量低于乳腺腺瘤组患者（ P ﹤0.05）；乳腺癌组患者的血清肝细胞生长因子（ HGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、Six1、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胸苷激酶1（TK1）、中期因子（MK）值均显著高于乳腺腺瘤组患者（ P ﹤0.05）；乳腺癌组织的EphA2、SIAH2、β-catenin表达量与MAGE-A11、FOXM1、Ki67、Cyclin D1、HGF、TGF-β、Six1、bFGF、TK1、MK值呈正比，与E-cadherin值呈反比（ P ﹤0.05）。结论乳腺癌组织中高表达的EphA2、SIAH2、β-catenin与肿瘤的增殖及侵袭转移等特性均关系密切，可以作为宏观判断肿瘤恶性程度的有效指标。
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EphA2基因表达水平与大鼠白内障发生的相关研究
目的：研究 EphA2基因在大鼠白内障晶状体中的表达水平变化的情况。方法选用18只SD大鼠的36个晶状体，分为3组，每组6只，分别为2月龄透明晶状体组（青年组）、12月龄透明晶状体组（老年组）和12月龄白内障晶状体组（白内障组）。采用实时荧光定量 PCR 和Western blot检测青年组、老年组和白内障组晶状体中EphA2基因和蛋白的表达水平。结果 Western blot检测结果显示EphA2蛋白在白内障组中表达水平明显低于老年组（t＝10.952，P＝0.000）；而老年组比青年组EphA2蛋白表达水平呈轻度的升高（t＝-4.456，P＝0.001）。Q-PCR结果显示，白内障组中的EphA2 mRNA表达水平较老年组呈明显的升高（t＝-4.518，P＝0.001）；老年组中的EphA2 mRNA表达水平较青年组呈轻度的降低（t＝8.237，P＝0.000）。结论 EphA2蛋白表达水平下降与大鼠白内障发生密切相关。随着大鼠年龄增加，EphA2蛋白表达水平呈轻度的升高。
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2017年ESMO结直肠癌领域研究进展解读——基础应用篇
European Society For Medical Oncology(ESMO)大会是欧洲具影响力的肿瘤专家年度会议.2017年ESMO大会于2017年9月8日至12日在西班牙马德里举行,大会将癌症研究人员和临床医生聚集在一起,开展合作,交流思想,促进实验室到临床以及从临床到实验室的相互转化.现将会议期间有关结直肠癌领域临床前沿及引申的基础研究诸如免疫治疗优化获益人群、转化研究、肿瘤标记物、肿瘤基因型和表型的变化与疾病预后以及治疗方式和/或药物选择的相关性、结直肠癌新靶点等做一简要梳理.
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EphA2/EphrinAl及E-cadherin在胰腺癌中的表达及临床意义
目的 探讨EphA2、EphrinAl及E-cadherin在胰腺癌及癌旁非肿瘤组织中的表达及临床意义.方法.采用免疫组织化学EnVision二步法,检测48例胰腺癌及癌旁非肿瘤胰腺组织中EphA 2、EphrinAl和E-cadherin的表达,并分析其与临床病理因素的关系.应用log-rank检验和Cox比例风险模型分析EphA 2、EphrinAl和E-cadherin的表达与患者预后的关系.结果 EphA 2、EphrinAl和E-cadherin在胰腺癌组织和癌旁非肿瘤组织阳性表达差异均有统计学意义.Ⅲ～Ⅳ期胰腺癌EphA 2、EphrinAl强阳性染色及E-cadherin阴性染色分别为47.9%、47.9%和64.6%,显著高于Ⅰ～Ⅱ期的6.25%、8.3%和14.6%(P<0.05).E-cadherin表达阳性与阴性患者术后生存率比较差异有统计学意义(P<0.05).Cox多因素分析表明,JPS分期、EphA 2阳性表达及E-cadherin阴性表达是反映胰腺癌预后的独立指标.结论 EphA2/EphrinAl与E-cadherin蛋白表达异常可能共同参与了胰腺癌的发生、发展与转移;联合检测三种蛋白对于评价胰腺癌的预后有一定参考价值.
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EphA2mRNA和VEGF在肝癌细胞中的表达及其关系
目的 探讨肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中EphA2mRNA(erythropoietin producing hepatoma cell lines)和VEGF(vascular endothelial growth factor)的表达及其关系.方法 用原位杂交的方法检测53例HCC组织及其癌旁组织中EphA2mRNA表达,并用免疫组织化学的方法检测HCC组织中VEGF的表达.结果 53例肝细胞癌组织及癌旁组织中EphA2mRNA的阳性率分别为86.79%(46/53)和69.81%(37/53),其差异有显著的统计学意义(W=2289.500,P＜0.001);肝癌组织中VEGF的阳性率为75.47%(40/53),癌旁组织中VEGF的表达为阴性.肝癌组织中EphA2mRNA和VEGF的表达显示:(1)表达水平与是否患有肝硬化无关;(2)表达水平分别与肝癌的临床病理学Edmondson分级呈明显的正相关(r=0.452,P=0.001;r=0.333,P=0.015);(3)二者之间的表达水平呈明显的正相关(r=0.425,P=0.002).结论 本实验表明:肝癌细胞中EphA2mRNA和VEGF呈过量表达;肝癌细胞中EphA2mRNA和VEGF的表达与肝癌细胞恶性程度以及二者之间密切关联.
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EphA2、nm23-H1在宫颈癌中的表达及与患者预后的关系
目的 探讨宫颈癌中EphA2、nm23-H1的表达及与患者预后的关系.方法 应用免疫组织化学方法检测50例官颈癌(鳞癌41例、腺癌9例)、10例慢性宫颈炎、25例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)中EphA2及nm23-H1蛋白表达.并对官颈癌患者进行8～46月随访,分析EphA2、nm23-H1在宫颈癌中的表达及与患者预后的关系.结果 EphA2蛋白在慢性宫颈炎、CIN、宫颈癌组织中阳性表达的差异有显著性(P<0.05),EphA2蛋白在宫颈癌中的表达与病理分级、淋巴结转移有相关性(P<0.05),且EphA2蛋白表达越强,患者生存率越低;nm23-H1在慢性宫颈炎、CIN的阳性表达率高于宫颈癌,差异有统计学意义(P<0.05),nm23-H1蛋白在宫颈癌中的表达与FIGO分期、淋巴结转移有相关性(P<0.05).宫颈癌中EphA2的表达与nm23-H1的表达呈负相关(P<0.05),EphA2表达阳性伴nm23-H1表达阴性的患者预后差.结论 EphA2及nm23-H1与宫颈癌患者预后关系密切,两者可望作为判断宫颈癌患者预后的参考指标.
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乳腺癌组织EphA2和EphrinA1蛋白表达及其临床意义的探讨
目的:研究EphA2和Ephri-1nA1蛋白在乳腺癌组织中的表达及其意义.方法:用免疫组织化学SP法检测130例乳腺癌组织中EphA2和EphrinA1的蛋白表达水平及其与临床病理因素的关系.结果:130例乳腺癌组织中,EphA2和EphrinA1蛋白的阳性表达率分别为72.31%和59.23%;EphA2蛋白在乳腺癌的阳性表达率与临床分期、淋巴结转移和组织学分级显著相关,P(0.05.EphrinA1蛋白的阳性表达率与临床分期、组织学分级显著相关,P<0.05.EphA2和EphrinA1蛋白阳性染色共同定位于大致相同的肿瘤区域和血管内皮细胞,两者在乳腺癌组织中的阳性表达显著相关,P<0.05.结论:EphA2和EphrinA1可能与乳腺癌的发生发展有关.它们的联合检测有助于客观评估乳腺癌的生物学行为,可用来指导临床用药和预测预后.
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EphA2在人膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义
目的 研究EphA2在在人膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义.方法 选取全膀胱切除后癌旁2.5cm以上镜下证实为对照组的膀胱黏膜11例,移行细胞癌标本48例,采用免疫组化1二步法,每个石蜡块标本切取5张切片.其中的4片分别用于:EphA2、VE-cadherin、Ki67作为一抗的研究,另外1片用于HE染色以确定该病例的WHO分级及分期.另外对患者的预后进行随访,随访6～50个月,对复发者与未复发者的EphA2的阳性表达情况进行统计,并对患者术后生存时间进行分析.结果 EphA2在膀胱TCC病理G1中的阳性表达率较低,只有14.3%;在G2级中阳性染色达到36.8%;在G3中阳性染色达到66.7%.通过两两比较,差异有显著性(P<0.01),而在正常膀胱黏膜组织中都是阴性.结论 EphA2过度表达可以促进细胞的增殖,血管形成,可能是通过VE-cadherin而起作用.复发患者的EphA2的阳性表达率明显高于未复发者,可以将其作为评估患者术后是否容易复发的一个指标,EphA2还可能是评估患者术后生存时间的一个指标,并且可能成为肿瘤靶向治疗的新靶点.
关键词： EphA2 VE-cadherin Ki67 MVD 膀胱肿瘤 -
肾癌中EphA2和EphrinA1的表达及其与微血管密度的关系
目的 探讨EphA2和EphrinA1在肾癌组织中的表达,及其与肿瘤血管生成的关系.方法 应用用免疫组化法检测68例肾癌组织、24例正常肾组织中EphA2和EphfinA1的表达,采用CD34抗体标记微血管内皮细胞,计算微血管密度(MVD).结果 肾癌组织中EphA2和EphrinA1蛋白的表达明显高于正常肾组织(均P<0.01).正常肾组织中MVD为25.23±7.09,肾癌组织中MVD为39.68±7.24,差异有统计学意义(P<0.01).在肾癌组织中,分化程度为2、3级组的EphA2和EphrinA1蛋白表达水平高于分级为1级组(P<0.01,P<0.05),分期为Ⅲ、Ⅳ期组高于Ⅰ、Ⅱ期组(P<0.01,P<0.05),有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P<0.05);肿瘤直径≥7 cm组的MVD高于<7 cm组(P<0.05),分化程度为2、3级组高于1级组(P<0.01),分期为Ⅲ、Ⅳ期组高于Ⅰ、Ⅱ期组(P<0.05),有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P<0.01).相关分析结果显示,EphA2、EphrinA1的表达与MVD呈正相关(r分别为0.555和0.485,均P<0.01).结论 EphA2和EphrinA1在肾癌组织中高表达,并与肿瘤的分化程度、临床分期、肿瘤血管生成有关.
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EPHA2-siRNA质粒对骨肉瘤细胞生物学行为的影响
目的 探讨骨肉瘤细胞中EPHA2基因表达对细胞增殖、凋亡以及仿血管发生的影响.方法 应用pSiliencer质粒构建靶向EPHA2的siRNA质粒;脂质体转染siRNA质粒入骨肉瘤细胞,Western blot在蛋白水平检测转染前后细胞基因表达情况;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪结合Annexin V-FITC和PI染色以及HE染色观察转染前后骨肉瘤细胞增殖、凋亡及仿血管发生情况.结果 成功构建了针对EPHA2的siRNA表达质粒;将质粒转染入骨肉瘤后,EPHA2基因在蛋白表达水平下调;骨肉瘤细胞增殖能力下降,并发生了早期凋亡,骨肉瘤细胞的仿血管发生受到抑制.结论 EPHA2参与了骨肉瘤细胞增殖、早期凋亡和仿血管发生;利用RNA干扰技术靶向EPHA2基因治疗可能为骨肉瘤治疗提供新方法.
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EphA2基因在脑星形胶质细胞瘤的表达
目的 检测EphA2基因在脑星形胶质细胞瘤中的表达并探讨其与星形胶质瘤病理分级、增殖和凋亡的关系.方法 选取90例人脑星形胶质瘤标本,以逆转录聚合酶链反应检测EphA2mRNA表达,以免疫组化法检测EphA2和Ki67蛋白表达,以TUNEL法检测凋亡,分别计算EphA2免疫反应评分(IRS)、增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)并进行统计学分析.结果 EphA2 mRNA和蛋白阳性表达率分别为47.8%和43.3%.EphA2 IRS、PI及AI分别为(2.90±3.89)%、(30.42±24.91)%和(1.42±0.99)%,三者均随肿瘤病理级别增高而升高.EphA2阳性组PI明显高于阴性组PI,PI与EphA2 IRS呈显著正相关;EphA2阳性组与阴性组之间AI差异无统计学意义,但AI与EphA2 IRS呈显著负相关.结论 EphA2在脑星形胶质瘤中高表达,其表达水平与肿瘤病理分级、增殖和凋亡密切相关,提示EphA2可能是参与脑星形胶质瘤恶性进展的重要分子.
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EphA2经p38 MAPK通路调控头颈部鳞状细胞癌血管内皮生长因子表达的研究
目的 阐明促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor,EphA2)蛋白可经p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路调控头颈部鳞状细胞癌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达.方法 采用脂质体2000将EphA2蛋白过表达载体pEGFP-N1-EphA2和空白载体pEGFP-N1分别转染头颈鳞状细胞癌Tu686细胞,酶联免疫吸附法检测EphA2蛋白上调后VEGF蛋白的表达,Western blot法检测p38 MAPK信号通路有无激活；进一步利用不同浓度(0、5、10 μmol/L)小分子抑制剂SB203580特异性阻断p38MAPK通路,酶联免疫吸附法检测VEGF蛋白的表达改变有无逆转.结果 Tu686细胞EphA2蛋白上调后,VEGF蛋白在空白载体组和亲本细胞组中的表达(x±s)分别为(400.99±33.50) pg/ml和(385.30±33.50) pg/ml,而在实验组中的表达显著升高为(535.31±45.71) pg/ml,差异有统计学意义(F=17.091,P＜0.01)；同时,实验组Tu686细胞磷酸化p38 MAPK的表达上调.不同浓度(0、5、10 μmol/L) SB203580作用EphA2蛋白过表达的Tu686细胞后,磷酸化p38 MAPK的表达则被梯度抑制,且VEGF蛋白的表达逐渐降低,分别为(643.75±52.00) pg/ml、(513.52±54.05) pg/ml、(302.85±13.93) pg/ml,三组间差异有统计学意义(F=45.761,P＜0.01).结论 EphA2蛋白对p38MAPK信号通路具有调控作用,并经该通路影响VEGF蛋白的表达.
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肿瘤血管生成相关因子CD105、 EphA2及其配体EphrinA1在喉鳞状细胞癌中的表达及意义
目的 探讨喉鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)中Endoglin(CD105)、促红细胞生成素产生肝细胞受体A2 (erythropoietin-producing hepatocyte receptor A2,EphA2)及其配体EphrinA1蛋白的表达及意义.方法 采用免疫组化SP法检测76例喉SCC和25例喉癌旁组织(adjacent normal laryngeal tissues)中CD105、EphA2及其配体EphrinA1的表达情况,分析它们与喉SCC患者临床病理因素的关系及对喉SCC预后判断的价值.应用SPSS 17.0统计软件包对数据进行分析,计数资料采用x2检验及Fisher精确检验.结果 喉SCC中以CD105标记的微血管密度(microvessel density,MVD)为10.33±2.29,大于喉癌旁组织(1.20 ±1.04),差异有统计学意义(t=18.732,P＜0.05).CD105标记的MVD的表达与喉SCC的T分级、组织学分级、临床分期、淋巴结转移、是否复发有关(F值分别为5.34、4.79、5.36,t值分别为-2.70、2.25,P值均＜0.05).EphA2、EphrinA1蛋白表达的阳性率在喉SCC分别为78.95％ (60/76)、81.85％ (62/76),大于喉癌旁组织的40.00％(10/25)、44.00％ (11/25),差异有统计学意义(x2值分别为13.41、13.26,P值均＜0.05).EphA2蛋白表达与喉SCC的组织学分级、T分级、临床分期、淋巴结转移、是否复发有关(x2值分别为6.25、14.60、15.11、8.52、5.54,P值均＜0.05).EphrinA1蛋白表达与喉SCC的淋巴结转移、T分级、临床分期、是否复发有关(x2值分别为6.44、12.28、16.78、6.44,P值均＜0.05).CD105、EphA2和EphrinA1蛋白表达两两之间均呈正相关(r值分别为0.72、0.74、0.64,P值均＜0.05).生存分析显示,CD105、EphA2、组织学分级、淋巴结转移、临床分期、有无复发是患者预后的独立影响因素(P值均＜0.05).结论 喉SCC中CD105与EphA2、EphrinA1蛋白的表达两两之间呈正相关,三者均促进喉SCC的发生、恶性发展,提示不良预后,联合检测三者的表达有助于喉SCC的诊断及预后判断.
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EphA2调控头颈部鳞状细胞癌血管新生及转移的体内实验
目的 研究EphA2对头颈部鳞状细胞癌(简称鳞癌)血管新生及颈淋巴转移的影响.方法 利用慢病毒介导的短发夹RNA( short hairpin RNA,shRNA)沉默EphA2在高转移性头颈鳞癌细胞株M2中的表达,嘌呤霉素筛选稳定克隆,反转录PCR及Western blot技术检测EphA2沉默效果；构建头颈鳞癌高转移动物模型,通过HE染色验证其成瘤及颈淋巴转移情况；免疫组织化学技术检测移植瘤微血管密度,Western blot技术检测移植瘤标本中EphA2及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况.结果 筛选出EphA2基因稳定沉默的M2细胞(定义为M2 EphA2 RNA+即实验组),并成功构建头颈鳞癌高转移动物模型,成瘤率达100％.25 d后,实验组移植瘤体积为(430.7±190.0) mm3(x±s,以下同)较对照组的(1179.0 ±289.4) mm3明显减少(t =5.597,P＜0.01),质量显著减轻(t=-4.560,P＜0.05),且双侧颈淋巴转移率明显降低(Mann-Whitney U=10.0,P＜0.05).Western blot 显示实验组移植瘤组织中EphA2及VEGF蛋白表达显著下调,免疫组织化学技术发现实验组瘤体微血管密度为(4.74±0.67)个/视野,显著少于对照组的(14.17±0.59)个/视野(t=26.751,P＜0.01).结论 EphA2沉默能抑制头颈部鳞癌细胞的生长及转移,并能明显减少头颈部鳞癌组织内的肿瘤新生血管,且该肿瘤新生血管的抑制可能与促血管生成因子VEGF的减少有关.
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鼠黑色素瘤眼内与皮下种植后血管生成拟态及其分子机制研究
目的 研究不同微环境对黑色素瘤局部循环模式的影响及其相关分子机制.方法 实验研究.将60只C57BL/6J小鼠随机分皮下组和眼内组,每组30只,将B16细胞悬液分别接种到鼠鼷部皮下与视网膜下腔,接种后14 d取材,检测移植瘤扩散与转移情况及瘤组织局部微循环模式,计数并比较血管生成拟态(MV)、马赛克血管(VM)、内皮依赖性血管(E);检查肿瘤组织的扩散及转移情况.采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化技术检测酪氨酸激酶受体-2(EphA2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-2(MMP-9)蛋白及其mRNA表达.进一步分析移植瘤中VM与EphA2、MMP-2及MMP-9 mRNA表达量的相关性.利用两组独立样本t检验分析眼内组与皮下组肿瘤组织各指标的差别,组内各指标之间的相关性用Pearson方法分析.结果 黑色素瘤眼内与皮下移植瘤中3种微循环模式共存,并且眼内组VM较皮下组增多,两组比较具有统计学意义(t=4.188,P=0.000),而MV和E在皮下移植瘤中高于眼内移植瘤,但两组比较无统计学差异(t=1.473,1.805;P=0.146,0.076).眼内组EphA2、MMP-2和MMP-9 mRNA表达量显著增加,高于皮下组(t=3.642,8.109,9.357.;P=0.002,0.001,0.001).在EphA2表达增高的同时VM也相应增多,二者呈正相关(r=0.412,P=0.021);VM增多与MMP-2和MMP-9表达增加也存在一定关系,但差异无统计学意义(P>0.05).眼内移植瘤中发现眶内扩散5例,肺转移6例.结论 微环境变化可使黑色素瘤的微循环模式发生改变,眼内移植瘤细胞可通过增加EphA2、MMP-2和MMP-9表达使VM形成增加,使VM成为眼内移植瘤主要供血模式,从而使肿瘤更具有侵袭性.(中华眼科杂志,2009,45:641-646)
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脉络膜黑色素瘤中上皮酪氨酸激酶受体A2的表达与血管生成拟态的关系及其临床病理学意义
目的 探讨在脉络膜黑色素瘤中上皮酪氨酸激酶受体A2(EphA2)的表达与血管生成拟态(VM)的关系及其临床病理学意义.方法 回顾性系列病例研究.收集天津医科大学第二附属医院眼科1992年1月至2005年12月56例脉络膜黑色素瘤标本及患者的临床病理学资料.采用免疫组织化学方法检测脉络膜黑色素瘤组织中EphA2的表达情况.经CD31/PAS双重染色证实VM存在,依据有无VM将标本分为VM(+)组和VM(-)组.结合肿瘤细胞EphA2表达的阳性率和染色强度结果综合评估,将标本分为低表达和高表达.采用x2检验和t检验分别分析计数资料和计量资料；Kaplan-Meier法分析不偶组患者的生存时间；Cox比例风险模型分析影响患者预后的因素.结果 56例脉络膜黑色素瘤中有VM 26例,无VM 30例；VM与细胞类型、肿瘤大小、复发与转移有关,差异均有统计学意义(x2 =4.612、5.346、5.213,P=0.036、0.021、0.027).在VM(+)组中EphA2表达的阳性率(92.3％,25/26)高于VM(-)组(70.0％,21/30),差异有统计学意义(t=2.247,P=0.009)；在不同组织学类型肿瘤中EphA2高表达情况依次为:上皮细胞型(10/12),混合型(11/15),梭形细胞型(41.40％),差异有统计学意义(x2 =6.513,P =0.010)；EphA2高表达与肿瘤大小、复发与转移有关,差异有统计学意义(x2 =4.556、8.211,P=0.016、0.005)；Kaplan-Meier生存分析提示,EphA2高表达与低表达患者生存时间的差异有统计学意义(t=9.263,P=0.000)；Cox比例风险模型分析表明,EphA2高表达与VM是影响脉络膜黑色素瘤患者预后的独立危险因素(x2=12.041,P=0.001),且二者呈正相关关系(r =0.412,P＜0.05).结论 EphA2高表达与VM是影响预后的不利因素,EphA2高表达促进了VM形成,且与肿瘤的分化、侵袭、转移密切相关,可作为评估预后的重要指标.
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EphA2基因过表达对高浓度地塞米松作用的人晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨构建人生促红素人肝细胞受体酪氨酸激酶A2(EphA2)基因慢病毒表达载体并体外转染人晶状体上皮细胞(HLE-B3系)的可行性及EphA2基因过表达对大剂量地塞米松作用的HLE-B3增殖及凋亡的影响.方法 实验研究.骨架质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP经NOT Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切线性化后和目的基因EphA2重组.重组产物转化大肠杆菌DH10B.以菌落PCR、酶切和DNA测序鉴定.采用脂质体2000转染表达载体至人293T/17细胞包装慢病毒.按感染复数(MOI)分别为20、50、100、200体外转染人HLE-B3,72 h后荧光显微镜下观察细胞形态;流式细胞术检测转染效率.选择佳MOI进行实验,免疫印迹法检测正常对照组、空载体转染组及EphA2基因慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白的表达.后续实验分为以下四组:A组(正常对照组)、B组(EphA2基因慢病毒表达载体转染组)、C组(地塞米松组)和D组(EphA2基因慢病毒表达载体转染联合地塞米松组).细胞计数试剂盒法(CCK-8)检测各组细胞存活率,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组细胞凋亡指数.采用单因素方差分析或双因素方差分析对相应实验数据进行统计学分析.结果 PCR、酶切和DNA测序鉴定均证实EphA2以正确的序列和方式成功插入载体.MOI为20、50、100、200时,转染效率分别为38.6％±3.9％、49.2％±4.2％、79.5％±5.5％、80.2％±6.0％.其中,MOI 100与200比较,转染效率无明显提高(P=2.507),但细胞形态变得不规则,确定佳MOI为100.空载体转染组与正常对照组比较,EphA2蛋白相对表达量差异无统计学意义(P=0.868);EphA2基因慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白相对表达量较正常对照组提高了4.4倍,差异有统计学意义(P=0.001).A组、B组、C组和D组细胞存活率分别为98.18％±1.85％、122.01％±3.89％、52.32％± 1.99％和76.18％±3.74％;组间比较,差异有统计学意义(F=497.6,P=0.001);两两比较差异均有统计学意义(P值均为0.001).A组、B组、C组和D组细胞凋亡指数分别为5.4％±1.5％、5.0％±1.8％、23.0％±3.9％、14.4％±2.7％;组间比较,差异有统计学意义(F=397.6,P=0.001);两两比较,A组与B组间差异无统计学意义(P=0.415),余两两比较差异均有统计学意义(P值均为0.001).结论 成功构建人EphA2基因慢病毒表达载体并实现了其在HLE-B3中的高效表达.EphA2基因过表达对HLE-B3具有促增殖作用,对地塞米松导致的HLE-B3增殖抑制具有保护作用.EphA2基因过表达对HLE-B3生理状态下的细胞凋亡无保护作用,对地塞米松导致的HLE-B3凋亡具有保护作用.
