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灯盏细辛转基因毛状根体系建立
采用电转化法将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的载体PBI-1300导入发根农杆菌C58 C1中,以农杆菌C58 C1工程菌为介导,叶盘法转化灯盏细辛无菌叶片,诱导并筛选出具有潮霉素抗性的毛状根,提取灯盏细辛毛状根基因组DNA,经GFP基因特异性引物扩增,得到与目的基因分子片段大小一致的DNA条带;双光子显微镜下观察可见明显的绿色荧光,上述结果表明GFP基因已成功地整合到灯盏细辛毛状根基因组中,并能够稳定表达.为进一步探究外源基因在灯盏细辛毛状根遗传转化体系中的高效表达奠定基础.
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慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况.应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体.之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况.结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml.感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%.结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率.
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IRES序列连接的D-氨基酸氧化酶与绿色荧光蛋白基因导入K562e细胞的表达
内部核糖体进入位点(IRES)序列来源于脑心肌炎病毒,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框,由其连接的两个基因的表达率相同.本实验应用以IRES序列连接D-氨基酸氧化酶(DAAO)和绿色荧光(GFP)基因构建的逆转录病毒载体,转染K562e细胞获得稳定表达GFP的单克隆细胞KDIGC和KDfGd,测定转基因细胞的荧光阳性率以及荧光强度,用D-丙氨酸(D-Ala)作用DAAO+细胞,并用酚红氧化法测定培养上清H2O2.结果表明,KDfGC和KDfaGD细胞的荧光阳性率分别为94.64%,96.31%;2×104细胞的荧光强度分别为202 U和174 U.GFP荧光强度与H2O2的产量间呈指数相关.结论:IRES序列调控的双基因可同时表达,GFP的荧光强度可以间接地反映DAAO基因的表达水平,为了解目的基因表达水平高低提供了新的方法.
关键词： D-氨基酸氧化酶基因 IRES序列 绿色荧光蛋白基因 基因转移 K562e细胞系 -
腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠成体肝干细胞中的表达
目的:研究腺病毒感染成体肝干细胞介导外源基因表达的可行性及建立稳定表达EGFP的成体肝干细胞.方法:采用细菌同源重组法构建CMW驱动的EGFP报告基因腺病毒载体pAd-CMV-EGFP,在293细胞中包装制备腺病毒,并用重组腺病毒感染体外培养的成体肝干细胞WB-F344,观察腺病毒携带的外源基因EGFP在WB-F344细胞中的表达,及分析病毒对肝干细胞的感染效率.进一步单克隆培养纯化建立稳定表达EGFP的细胞株(WBEGFP),并采用流式细胞技术、免疫细胞化学技术、诱导分化实验以观察其生物学特性.结果:成功构建腺病毒载体,并包装制备高滴度的重组腺病毒Ad-EGFP.重组腺病毒有效的感染WB-F344细胞,感染率约40-70%.建立WB-EGFP细胞株,持续传代8-9代均较稳定表达EGFP及肝干细胞表面标记,仍保持干细胞样的增生、分化等基本生物学特性.结论:腺病毒可高水平的介导外源基因表达于成体肝干细胞,是有效的基因转移系统.稳定表达EGFP的肝干细胞株观察直观、可连续传代,并保持干细胞的生物学特性,可用于体内外肝细胞研究中的追踪、鉴定.
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转导S基因的树突状细胞对肝癌患者细胞免疫的影响
目的:将乙肝病毒表面抗原基因(S基因)转导树突状细胞(DC),观察DC在体外诱导肝细胞癌患者淋巴细胞的免疫反应,探讨用基因工程方法制备的DC作为肿瘤疫苗激发特异性抗肝癌免疫作用的可行性.方法:分离7例肝细胞癌患者的DC,每例分为单纯培养组、绿色荧光蛋白基因(GFP)转导组和S基因转导组培养.用基因工程的方法构建含有S基因和GFP的重组腺相关病毒rAAV-S和rAAV-GFP,转导相应组的DC,转导成功后再诱导来自同一患者的淋巴细胞.通过IFN-γ分泌检测法测定诱导后的淋巴细胞对表达表面抗原的细胞株HepG2215的免疫杀伤情况.结果:构建的rAAV-S和rAAV-GFP分别成功的转导树突状细胞.诱导后测定S转导组、GFP转导组和单纯培养组淋巴细胞中分别有31.99±5.71%、9.90±1.53%和2.49±0.91%的细胞能够分泌INF-γ.三组结果间具有显著性差异(P＜0.01三组间的t值分别为10.99、13.49、9.88).结论:转导S基因的树突状细胞可在体外诱导出特异性细胞免疫反应.基因工程制备的DC可作为特异性肿瘤疫苗应用于肝细胞癌的免疫治疗.
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肝癌基因治疗研究进展
肝癌是世界上恶性程度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，每年全球约有125万人患病。在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位，每年至少有10万名新发现病人，和11万名肝癌病人死亡〔1〕。尽管目前肝癌的治疗方法有许多种，但治疗效果都十分有限，并未显著延长病人的生存期。大部分肝癌病人对化疗及放疗等治疗均不敏感，能手术根治的病人仅占15%。随着分子生物学和免疫学理论及技术的不断发展和对肿瘤发病机制的不断认识，人们可以利用基因工程的手段进行肝癌的基因治疗，且在该领域已显示出一定的临床治疗效果。如Habib等〔2〕使用野生型p53基因治疗原发性肝细胞癌的临床治疗试验，取得了很大的成功，引起人们的普遍关注。本文就目前肝癌基因治疗的研究现状和发展趋势作一综述。 一、肝癌基因治疗中所使用的载体系统和治疗途径的选择 目前在肝癌基因治疗实验当中使用多的是病毒载体系统，包括腺病毒载体〔3〕、逆转录病毒载体〔4〕、腺相关病毒载体〔5〕等，非病毒载体系统主要是使用脂质体〔2，6〕介导，且已进入临床试验阶段。在肿瘤基因治疗中，腺病毒载体系统具有许多优点，如制备容易，能获得高纯度、高滴度的腺病毒体；无遗传毒性，以游离型状态存在，不整合进入宿主DNA中；表达时间相对短暂，一般15～20 d左右，不会造成对免疫系统的长期慢性刺激〔7〕；感染宿主范围相对较广，尤其是能感染复制、分裂期的细胞。近几年临床上使用腺病毒载体治疗恶性肿瘤的例子越来越多〔8〕。体外实验证实，数个人的肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Hnh7、HLE、HLF、SK-HEP-1和大鼠肝癌细胞系McA-RH7777等，均对腺病毒十分易感，50MOI可使近100%的细胞被感染〔9〕。作者曾在军事医学科学院百环生物医学研究中心吴祖泽院士指导下，以腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因作为标记基因，也证实3个人的肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、BEL-7402，一个胆管癌细胞系QBC939，一个正常肝细胞系L02，均对腺病毒易感，50MOI可使90%左右的靶细胞受感染。Castell等〔10〕利用携带LacZ基因的腺病毒体，感染体外原代培养的正常肝细胞，结果证实：肝细胞对腺病毒十分易感，15MOI感染1 h，可使80%的肝细胞受感染，20MOI感染1 h可使100%的肝细胞受感染；导入的目的基因可以在肝细胞内高效表达；感染腺病毒后，并不影响肝细胞的正常生化功能，如肝细胞的尿素合成、胞膜蛋白合成、生物转化活性等，认为使用腺病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗，是十分有效的工具载体。但有实验表明大剂量腺病毒载体对肝功能还是有影响的〔11〕，随感染病毒量的加大，肝脏的毒性作用也加大，且感染腺病毒的靶细胞刺激机体产生免疫反应，从而使腺病毒的转化效率降低，限制了重复使用。使用逆转录病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗，也有其有利之处：因逆转录病毒只感染处于复制、分裂期的细胞，而处于非复制期的细胞则不受感染。因肿瘤细胞多处于分裂期，而肿瘤周围的正常肝细胞多处于静止期，故逆转录病毒载体具有一定的靶细胞特异性〔4〕。Kitten等〔12〕使用逆转录病毒载体，通过门静脉注入大鼠肝内，有46%±17%的肝细胞受到感染，随病毒滴度的升高，细胞的转导效率也 增加。虽然逆转录病毒载体能将目的基因有效地导入肝癌细胞内，对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适，但系统体内(in vivo)法应用，就会对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛的组织，产生致死性杀伤作用，有产生与放、化疗相似副作用的危险。对于原发性肝细胞癌，癌细胞的增殖生长一般比较缓慢〔12〕，因此使用逆转录病毒载体可能转化效率较低，但对于肝转移癌，因为细胞增殖较为旺盛，故使用逆转录病毒载体较为合适。对于使用腺相关病毒载体进行肝癌的基因治疗，目前还研究较少，但腺相关病毒无致病性，有广泛的宿主范围，能感染不分裂的S期细胞，并能整合到宿主DNA的特异部位中，故减少了发生插入突变的危险性。Su等〔5〕使用AAV介导AFP/HSV-TK基因，证实目的基因能在肝癌细胞中高效表达，并具有杀伤肝癌细胞的作用。
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含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测
目的评价以整合素为靶向的新型非病毒载体系统--含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(记作K16-RGD)作为基因转染载体的可行性.方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体与不同比例的增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)混合转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),72 h后用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况.结果转染效率与K16-RGD和质粒的比例有关,转染体系中K16-RGD(μg):pEGFP(μg)为3:1时EGFP有高的表达效率.结论含RGD肽K16-RGD能有效介导外源基因在BMSCs内的转染和表达,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础.
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高效绿色荧光蛋白基因标记系统的建立及其初步应用
逆转录病毒载体编码的众多报告分子被广泛用于分析基因转导率、分选或示踪基因修饰靶细胞,特别在改进基因转导条件、阐明造血干细胞(HSC)生物学特性和判定白血病复发的细胞来源等方面发挥了重要作用[1,2].作为新一代的报告分子,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)近已被用于造血细胞的基因转移和示踪肿瘤转移与血管形成等研究[3].我们曾建立双启动子逆转录病毒载体介导的EGFP基因转移系统,但发现转导靶细胞后荧光强度较低[4].为提高靶细胞EGFP的表达,我们构建了仅携带EGFP单基因的逆转录病毒载体GIFP,并在不同类型靶细胞获得高效表达,为在体内进行基因标记研究提供了一种有效的工具.
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应用含标记基因K562细胞制备的小鼠白血病模型
背景:文献报道应用NOD/SCID及SCID小鼠可以建立移植性人白血病小鼠模型,但由于小鼠存在免疫缺陷,使得在自体干细胞移植及移植后相关过继免疫治疗方面的研究受到限制和影响.目的:探索用SPF级Balb/c小鼠和转染GFP及NeoR基因的K562细胞株制各自血病模型的方法.方法:实验分为5组,A、B组和C、D组分别经x射线照射2Gy和3Gy,24 h后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞,A、C组尾静脉注射2×106个/只;B、D组尾静脉注射5×106个/只:E组为正常对照组.观察小鼠生存时间,进行骨髓细胞及外周血白细胞分类,采用流式细胞仪测定GFP阳性细胞及PCR方法测定Neo基因.结果与结论:实验各组在接种5-7 d时发病.分别于30,23,24,17 d内全部死亡;生存天均显著短于正常对照组(P<0.01).体质量均较正常对照组显著下降(P<0.05),小鼠的向血病发病率为100%,无自发缓解.随接种细胞数量的增加和照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加,流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在肝、脾中的存在.结果证实Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以制备抉得白血病小鼠模型.
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经不同途径注射的绿色荧光蛋白基因在大鼠颌下淋巴结的表达
目的 研究阳离子聚合物梭华-Sofast基因转染试剂(sofast gene transferreagent,Sofast)介导的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene,PEGFP-N2)经不同途径注射后在大鼠颌下淋巴结(submandibular lymph nodes,SMLN)的表达情况,并寻求将外源基因转染到颌下淋巴结的佳途径.方法 经右眼前房、结膜下、颞下方穹隆部和下睑皮下给大鼠注射Sofast基因转染试剂和PEGFP-N2的复合物Sofast/DNA,通过荧光显微镜检查和流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测各组大鼠同侧的颌下淋巴结PEGFP-N2基因的表达分布和表达量.结果 注射Sofast/DNA复合物48 h后,前房注射组、结膜下注射组、颞下方穹隆部注射组和下睑皮下注射组的同侧颌下淋巴结均可检测到荧光表达.颞下方穹隆部注射组[(12.86±1.59)%]和下睑皮下注射组[(13.83±2.61)%]的流式细胞仪检测的阳性表达细胞的百分比高于结膜下注射组[(5.74±1.59)%]和前房注射组[(6.53±1.56)%](P＜0.01).结论 经Sofast介导的PEGFP-N2在大鼠颞下方穹隆部注射和下睑皮下注射后可以直接有效地在同侧颌下淋巴结表达.
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不同载体介导的绿色荧光蛋白基因在大鼠颌下淋巴结的表达
目的 探讨阳离子聚合物Sofast基因转染试剂(Sofast)和阳离子脂质体Lipofectamine2000(Lipo)经不同途径向大鼠转入绿色荧光蛋白基因(PEGFP-N2),观察其在颌下淋巴结(SMLN)的表达.方法 45只Wistar大鼠随机分成9组:Lipo/DNA前房注射组(A)、结膜下注射组(B)、颞下方穹隆部注射组(C)和下睑皮下注射组(D);Sofast/DNA前房注射组(E)、结膜下注射组(F)、颞下方穹隆部注射组(G)、下睑皮下注射组(H)和阴性对照组(I).分别于注射后48小时取同侧SMLN,通过荧光显微镜观查和流式细胞仪(FCM)检测各组的SMLN中PEGFP-N2的表达.结果 A-D、E-H各实验组的SMLN中均可观察到绿色荧光.相同载体不同部位注射DNA后颞下方穹隆部注射组和下睑皮下注射组可以获得相对较高的转染效率.相同部位不同载体注射DNA后Sofast/DNA注射组的转染效率高于Lipo/IDNA注射组.结论 Sofast在SMLN的基因转染中优于Lipo.DNA/Sofast可以通过颞下方穹隆部注射和下睑皮下注射在SMLN获得相对较高的表达.
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腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染及毒性
目的研究腺相关病毒(recombinant adeno-associatd virus,rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)对体外培养虹膜色素上皮细胞(irispigment epithelial,IPE)的转染和病毒载体对IPE细胞的毒性,为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据.方法酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定.按转染倍数(multiple of infection,MOI)为103、104、105、106转染已培养3d的传二代IPE细胞,流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率.MTT法检测rAAV-GFP对IPE细胞的毒性.结果rAAV-GFP对IPE的转染效率,MOI=103时为26.7%、MOI=104时为53.6%、MOI=105时为60.2%、MOI=106时是63.7%.AAV-GFP转染IPE细胞后,细胞生长正常,MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异.结论rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上,而且腺相关病毒对细胞生长无明显抑制,腺相关病毒作为视网膜色素变性基因治疗的载体是安全可行的.
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腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达
目的研究重组腺相关病毒(rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因(GFP)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达,为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据.方法酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定.按转染倍数(MOI)为103、104、105、106转染已培养3 d的传二代IPE细胞,转染后的第1、3、5、7、9 d,在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况,记录100个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比.当GFP表达稳定后,共聚焦显微镜照相,流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率.结果rAAV-GFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆.MOI=103时,转染后48 h,GFP开始表达,MOI=104、105、106时,转染后24 h时便可看到GFP表达阳性的细胞,细胞的起始表达强度不一,随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7～9 d达到高峰并维持,此时检测rAAV-GFP对IPE的转染效率,MOI=103时是26.7%,MOI=104时是53.6%,MOI=105时是60.2%,MOI=106时是63.7%.结论rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上,将腺相关病毒载体介导的基因治疗和IPE移植结合起来治疗视网膜色素变性是可行的.
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绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞
目的建立以增强型绿色荧光蛋白基因示踪骨髓间质干细胞的方法.方法采用密度梯度离心法分离、培养兔骨髓间质干细胞,以脂质体介导法转染增强型绿色荧光蛋白基因的表达质粒,荧光显微镜观察基因表达及转染效率.结果绿色荧光蛋白在基因转染12 h后开始表达,48～72 h达高峰,并在1周内有较强的表达,以后逐渐减弱,4周左右仍有少量表达,转染效率与质粒、脂质体的浓度有关,外缘基因导入后不影响骨髓间质干细胞的生长和增殖.结论脂质体介导的绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞后能安全、有效地表达,转染效率为20%～30%,是一种较为理想的干细胞示踪方法.
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AAV载体介导的人β2-AR、EGFP基因导入心肌细胞的研究
目的:观察腺相关病毒(adeno-assoiated virus,简称AAV)载体介导的人β2肾上腺素能受体(简称β2-AR)基因和增强型绿色荧光蛋白基因(简称EGFP)对心肌细胞的转染及其表达. 方法:构建以串联方式携带β2-AR、EGFP基因的AAV载体,转染大鼠的心肌细胞,检测心肌细胞β2-AR、 EGFP的表达及cAMP的含量.结果:Northern印迹杂交显示转染的心肌细胞表达人β2-AR mRNA;Western免疫印迹杂交分析表明转染的心肌细胞有人β2-AR;并在荧光显微镜下可观察到心肌细胞表达EGFP;放射性配基检测显示转基因心肌细胞的β2-AR密度(204.0±6.4 fmol/mg蛋白)明显高于未转染的心肌细胞(76.0±2.8 fmol/mg蛋白)(P＜0.01);经10 μmol/L异丙肾上腺素作用,转基因的心肌细胞的cAMP量(116.2±5.8 pmol/106cells)明显高于对照组(58.4±4.6 pmol/106 cells)(P＜0.01).结论:人β2-AR、EGFP基因经AAV载体导入心肌细胞后能有效地表达,且表达人β2-AR具有激活肾上腺素信号的作用.
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1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究
目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.
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绿色荧光蛋白基因在脂肪细胞分化研究中的应用
目的建立人脂肪细胞分化的绿色荧光蛋白活体检测动态模型,为进一步进行脂肪细胞分化及其相关基因表达研究奠定基础.方法用PCR法从培养的人前脂肪细胞总DNA中扩增出过氧化物体酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因启动子,将该启动子插入真核细胞表达载体pEGFP-1后转染3T3成纤维细胞及人前脂肪细胞,并诱导脂肪细胞分化.结果在胰岛素、地塞米松及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导下,人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞时表达绿色荧光蛋白基因,而3T3细胞则不能诱导为脂肪细胞及表达绿色荧光蛋白基因.结论脂肪组织特异表达的PPARγ2基因启动子与绿色荧光蛋白基因构成的重组基因转化人前脂肪细胞后,能够用来动态活体检测脂肪细胞分化状态.这一模型的建立为脂肪细胞分化调控的分子机制研究提供一个更加方便的检测途径.
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基于 Cre-LoxP 系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P 的构建与鉴定
目的：基于 Cre-LoxP 系统构建携带 EGFP 及 Puromycin 抗性基因，并带有巨细胞病毒（CMV）及翻译延伸因子1α（EF1α）双启动子的新型慢病毒表达载体，为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统．方法：以已经插入 LoxP 序列的 pLOX-TERT-iresTK 慢病毒载体为模板，用 SpeI 与 KpnI 进行双酶切，去除 TERT-iresTK片段，然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接，构建 pLOX-MCS 表达载体．同时，以 pB513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro 表达框（带有 BamHI 及 KpnI 酶切位点），然后与经过 BamHI 及 KpnI 双酶切的 pLOX-MCS 载体连接，进而构建 pLOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro（简称 pLOX-CMV-E ／P）载体．将 pLOX-CMV-E ／P 载体与慢病毒包装载体pCMVR8．74及 pMD2．G 共转染293T 细胞，包装病毒进行报告基因的功能分析．结果：菌落聚合酶链式反应（PCR）、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致，绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能．结论：成功构建了pLOX-MCS 及 pLOX-CMV-E ／P 慢病毒表达载体，为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统．
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携带IP-10基因双歧杆菌载体的构建及鉴定
目的 构建并鉴定携带人γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭分泌型表达载体,探索抗肿瘤基因治疗的新型载体.方法 用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,通过PCR方法克隆双歧杆菌的内源性阿拉伯糖苷酶的启动子和分泌性信号肽DNA序列(ara).然后以大肠杆菌质粒pBAD-A和pBS-T为基础,以ara启动子取代原有的启动子,以绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒pBS-BPP-ara-GFP.通过PCR方法扩增真核表达载体pBLAST49-hIP-10质粒中的IP-10基因,将其克隆到穿梭质粒pBS-BPP-ara-GFP中,采用电转化法将正确克隆的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒导入双歧杆菌中,并以L-arabinose诱导表达.在激光共聚焦显微镜下观察转基因双歧杆菌中GFP蛋白的表达;运用免疫蛋白质印迹(Western blot)检测转基因双歧杆菌中IP-10的蛋白表达水平.结果 含GFP基因的转基因双歧杆菌在激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光.含IP-10基因的转基因双歧杆菌经Western blot检测到分子量为8.47 kD的目的 蛋白条带.结论 成功构建能表达IP-10蛋白的穿梭质粒载体pBS-BPP-ara-GFP-IP-10,为IP-10转基因双歧杆菌的抗肿瘤机制及其抑瘤效应的研究奠定基础.
关键词： 长双歧杆菌 绿色荧光蛋白基因 γ干扰素诱导蛋白10 -
绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测
目的检测绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达载体pEGFP对MSCs的转染效率及瞬时表达,为利用pEGFP构建骨形成蛋白(BMP)表达载体并转染骨髓基质干细胞(MSCs)提供依据.方法在体外扩增并酶切鉴定pEGFP质粒;抽取兔骨髓,应用贴壁法培养MSCs;质粒与脂质体按照不同的比例混合,以脂质体介导法转染pEGFP,应用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况.结果转染效率与脂质体和质粒的比例有关,绿色荧光蛋白在基因转染24 h后开始表达,48～72 h高,1周后表达逐渐减弱,但3～4周后仍有少量表达.结论按照合适的质粒和脂质体比例,pEGFP转染MSCs的效率可达到30%,并能持续表达3周以上,是转染MSCs较为理想的瞬时表达载体.
