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小鼠Islet-1基因慢病毒表达载体的构建及其诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞特异性分化
目的 研究Islet-1对干细胞分化的影响.方法 用PCR钓取目的 基因,将目的 基因与pLenO-WPI载体连接,选取阳性质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体.感染C3H10T1/2细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测Islet-1和心肌、肝脏、骨骼及神经各系统相关标志物的表达,免疫荧光检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达部位.结果 PCR及测序显示目的 片段正确插入,实验组有Islet-1表达;心肌早期发育相关基因GATA-4、MEF2C、NKx2.5在检测到荧光蛋白1周后升高,2周到达高峰,3周后可检测到心肌特异性蛋白cTnT(0.582±0.0576),其时序性表达呈随时间增强趋势;cTnT表达于胞质;肝脏系统特异性标志AFP及ALB、骨骼系统特异性标志BGP及BALP、神经系统特异性标志Nestin及GFAP均未表达.结论 Islet-1具有特异性促进干细胞向心肌样细胞分化的作用.
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人CYP4Z1基因重组慢病毒载体的构建、鉴定及抑制乳腺癌细胞增殖
目的 研究CYP4Z1 RNAi慢病毒表达载体作用人乳腺癌细胞后对CYP4Z1 mRNA表达及对细胞增殖和MAPK信号通路的影响.方法 用RT-PCR和Western blot检测MDA-MB-468、T-47D和MDA-MB-231细胞中CYP4Z1的表达.构建3种CYP4Z1 RNAi慢病毒载体,转染CYP4Z1高表达的乳腺癌细胞,筛选出干扰效果好的靶点序列.用RT-PCR检测转染后CYP4Z1 mRNA表达.用MTT和Western blot分别检测CYP4Z1 siRNA后对乳腺癌细胞增殖和MAPK信号通路的影响.结果 在MDA-MB-468细胞中CYP4Z1 mRNA和蛋白表达显著高于MDA-MB-231及T-47D乳腺癌细胞(P<0.05).成功构建了3组重组慢病毒载体(LV-CYP4Z1-RNAi-1/2/3),3组重组慢病毒感染MDA-MB-468细胞系后,CYP4Z1 mRNA的表达受到抑制,其中以LV-CYP4Z1-RNAi-2组抑制作用显著,敲减率达到81％(P<0.01).与正常对照组相比,CYP4Z1-RNAi-2组MDA-MB-468细胞增殖受到抑制,p-ERK1/2表达水平显著降低(P<0.05).结论 成功构建了CYP4Z1 RNAi慢病毒表达载体,且CYP4Z1-RNAi-2可通过下调ERK1/2通路抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖.
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miR-30a表达载体构建、病毒包装和表达活性的检测
目的 构建携带miR-30a的慢病毒表达载体,为研究miR-30a在慢性粒细胞白血病中的作用机制及对伊马替尼耐药性的影响奠定基础.方法 提取人骨髓细胞基因组DNA,扩增miR-30a的前体序列,克隆到plVTHM慢病毒表达载体上,测序鉴定.重组载体进行病毒包装,感染K562细胞,测定病毒滴度.感染的K562细胞用流式细胞仪分选带有绿色荧光的GFP阳性的细胞,对分选的细胞用实时荧光定量PCR法检测miR-30a在细胞内的表达水平.后用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况.结果 重组慢病毒表达载体测序完全正确;病毒滴度检测为6×106 TU/mL;选用160 μL病毒液/1 mL培养基感染K562细胞;感染的K562细胞中miR-30a的表达水平显著增强(P＜0.05);过表达miR-30a后K562细胞增殖水平显著下降(P＜0.05).结论 成功构建了miR-30a慢病毒表达载体,并可在K562细胞中稳定表达,且miR-30a有抑制K562细胞增殖的作用.
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大鼠Olig2基因慢病毒表达载体的构建及其转染后对少突胶质前体细胞分化的影响
目的 构建大鼠少突胶质细胞转录因子2(Olig2)的慢病毒表达载体,并转染少突胶质前体细胞(OPCs),观察Olig2过表达对OPCs向少突胶质细胞(OLs)分化的影响.方法 设计合成PCR引物,从大鼠pEGFP-N3-Olig2表达质粒中扩增并克隆大鼠Olig2-EGFP片段,将其插入到pLenti6.3慢病毒表达载体中,形成pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体.将其与包装质粒混合后共转染293T细胞,包装产生慢病毒后感染培养的OPCs,观察Olig2在感染细胞中的表达并鉴定其表达对OPCs向OLs分化的影响.结果 成功将大鼠Olig2-EGFP片段克隆入pLenti6.3慢病毒表达载体,构建的pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体能够高效表达.与空质粒转染的OPCs相比,重组质粒转染的OPCs体外诱导分化后产生更多的OLs (n =5,P＜0.01).结论 成功建立大鼠pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达系统,慢病毒介导的Olig2过表达促进大鼠OPCs向OLs分化.
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SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响
目的:Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向siRNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法:设计并合成3条SMO基因靶向siRNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Westernblot法检测SMO蛋白表达.结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×108 TU/mL,1.49×109TU/mL及8.50×108 TU/mL,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86,00％、74.85％及19.22％,效果优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率＞80％.结论:成功构建携带SMO基因靶向siRNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.
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慢病毒介导的RNAi下调miR-221抑制U87胶质瘤细胞生长的研究
目的 探讨下调miR-221对U87胶质瘤细胞生长的影响及可能的作用机制.方法 构建靶向miR-221的siRNA慢病毒表达载体并感染U87胶质瘤细胞,应用原位杂交、定量PCR和Western blot法检测干扰后细胞内miR-221及p27蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化,Transwell法检测细胞侵袭力改变.结果 成功构建了靶向miR221的siRNA慢病毒表达载体,该载体能有效抑制内源性miR-221的表达,同时上调p27蛋白的表达,同时抑制细胞生长,诱导凋亡,降低细胞的侵袭力.结论 成功构建靶向miR-221的RNAi慢病毒表达载体,该载体能够有效抑制miR-221的表达并抑制U87胶质瘤细胞的生长,为以miR-221为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础.
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大鼠HO-1基因慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建携带大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)的慢病毒表达载体.方法 构建HO-1基因表达质粒GV208-EGFP-HO-1,并进行测序鉴定.重组质粒GV208-EGFP-HO-1与两种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后测定病毒滴度.结果 成功构建HO-1基因表达质粒GV208-EGFP-HO-1,转化感受态DH5α大肠杆菌.挑阳性单克隆PCR得到1074 bp的特异性条带,测序结果与目标序列完全一致.将HO-1基因过表达载体质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞后在荧光显微镜下发出明显绿色荧光.Western Blot检测观察到58 kD附近处有特征条带,其大小和目的基因融合蛋白相吻合.病毒原液滴度为2×1012 TU/L.结论 成功构建HO-1的慢病毒表达载体,为研究HO-1基因对缺血性心脏病的影响打下基础.
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慢病毒重组ACE2基因表达载体的构建及其感染人脐静脉内皮细胞的研究
目的 构建携带血管紧张素转换酶2(ACE2)基因的慢病毒表达载体,观察其感染人脐静脉内皮细胞后ACE2基因的转录及表达水平.方法 采用PCR技术从含有ACE2基因的质粒克隆模板pcDNA3.1-hygro (+)-mACE2上钓取ACE2基因,并将ACE2基因重组到慢病毒载体表达质粒pGC-Fu中,构建重组慢病毒载体表达质粒pGC-FU-ACE2,通过酶切、测序验证ACE2基因后,将pGC-FU-ACE2质粒和包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ACE2基因的重组慢病毒Lentiviral-ACE2;然后感染人脐静脉内皮细胞,通过RT-PCR、Western-blot检测ACE2基因的转录和蛋白表达水平.结果 成功构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体Lentiviral-ACE2,并获得大量高纯度的慢病毒浓缩液.目的基因ACE2能被重组慢病毒高效地导入人脐静脉血管内皮细胞,并能高水平表达.结论 慢病毒表达载体Lentiviral-ACE2成功构建并能高效率感染人脐静脉内皮细胞,为研究ACE2对血管内皮细胞的影响和更深入地探索ACE2基因的功能奠定了基础.
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人真核表达质粒载体plenti6/v5-D-TOPO-TβRⅡDNglytk的构建及鉴定
目的:鉴于TGFβ在肿瘤发展过程中的负性免疫调节作用.使T淋巴细胞对TGFβ失去敏感性可以恢复其对肿瘤的杀伤活性.拟用含有TβRⅡDnglytk质粒的慢病毒来感染T淋巴细胞使其对TGFD失去敏感性后发挥抗肿瘤效应,因此我们首先构建含有TβRⅡDnglytk的人真核表达的慢病毒质粒载体plenti6/v5-D-TOPO-TβRⅡDnglytk.方法:从质粒上将TβRⅡ DN及HSV-tk克隆下来,重组PCR技术将其构建为融合蛋白TβRⅡDnglytk,琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化;再利用TOPO克隆技术将其连接到慢病毒质粒pLenti6/V5-TOPO上,将质粒测序验证.结果:测序结果证明已将TβRⅡDN和HSV-tk构建成融合蛋白TβRⅡDnglytk并克隆到慢病毒载体plenti6/v5-D-TOPO中.成功构建了含TβRⅡDnglytk的人真核表达的质粒载体plenti6/v5-D-TOPO-TβRⅡDnglytk,经测序鉴定图谱正确.结论:成功构建了人真核表达的质粒栽体plenti6/v5-D-TOPO-TβRⅡDnglytk,联合应用重组PCR与TOPO克隆技术能够简单、高效、快速的构建慢病毒质粒.
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可调控BMP-2表达的单质粒载体构建及其在ADSCs中的表达研究
目的:拟构建可调控骨形态发生蛋白(BMP-2)表达的单质粒慢病毒表达载体,为研究骨修复过程中的成骨性能打下基础.方法:通过基因重组技术获取含BMP-2的慢病毒表达载体,通过菌落PCR和基因测序鉴定;将慢病毒表达载体与包装载体pMD2.G和pSPAX在293T细胞中包装,收集病毒液,转染大鼠脂肪基质干细胞(ADSCs).首先,从细胞形态学和MTT来初步分析诱导剂多西环素(Dox)不同浓度对ADSCs活性的影响;其次,缩小Dox浓度范围,在荧光显微镜下通过荧光表达强度判断Dox对ADSCs中基因表达的诱导效率,相同条件下,qRT-PCR分析BMP-2的mRNA的相对表达量,进一步优化Dox的诱导浓度;后,通过Western blot检测不同Dox浓度下,转染目的基因的ADSCs中BMP-2表达,Image J软件进行灰度值分析判断二者之间的剂量依赖关系.结果:1％琼脂糖凝胶电泳证实pUC57-BMP-2经双酶切后可获得大小约1 100 bp的目的基因片段,菌落PCR和基因测序证实含目的基因的慢病毒表达载体pLVCT-BMP-2构建成功.ADSCs对Dox大耐受浓度为6μg/mL,Dox对ADSCs中目的基因表达的大诱导浓度为5μg/mL,Western blot证实ADSCs中BMP-2表达与Dox浓度(0～5 μg/mL)存在剂量依赖关系.结论:成功构建可调控BMP-2表达的单质粒慢病毒表达载体,转染ADSCs后,BMP-2的表达与Dox浓度存在剂量依赖关系.
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STAT3-siRNA慢病毒表达载体的制备及其在SW480细胞中的表达
[目的]通过慢病毒感染SW480细胞观察RNAi对细胞内STAT3基因表达的影响.[方法]制备STAT3干扰质粒,与其它3种质粒共同转染至293T细胞中组装为STAT3-siRNA慢病毒表达载体.流式测定病毒滴度后选择适滴度感染SW480细胞并进行分选.Real-time PCR及Western blotting分析该慢病毒在SW480细胞中对于STAT3基因表达的影响.[结果]测序结果说明制备的慢病毒表达载体符合实验预期.该siSTAT3慢病毒感染SW480细胞后,流式细胞仪检测发现SW480细胞凋亡比率增加,Rea1-time PCR检测发现慢病毒对于STAT3 mRNA表达量的干扰效率为78.68％,Western blotting检测发现STAT3蛋白表达量下降,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]本研究制备的STAT3-siRNA慢病毒表达载体,能够有效干扰结直肠癌SW480细胞株STAT3表达.
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共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化
背景：基于干细胞的组织工程技术作为治疗骨关节损伤修复的有效手段，具有广泛的应用前景。研究表明miRNA在调控干细胞向软骨分化过程中具有重要的作用。
目的：探讨共感染慢病毒介导的反义miR-221-3p/222-3p(microRNA-221-3p，microRNA-222-3p)对人骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用，为临床软骨损伤修复提供新的策略。
方法：利用miRNA基因芯片技术筛选转化生长因子β3诱导人骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中不同阶段表达差异的miRNA，并利用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)验证；构建慢病毒人反义miR-221-3p/222-3p载体(Lv-miR-221-3p-inhibition ， Lv-miR-222-3p-inhibition)并共转染人骨髓间充质干细胞，空载体组(Lv-GFP)以及未转染组作为对照。利用CCK-8法检测沉默miR-221-3p/222-3p 6 d后细胞的增殖情况；通过番红O染色法、免疫组织化学方法以及RT-PCR验证各组软骨诱导21 d后软骨分化相关标志物的表达。
结果与结论：构建的Lv-miRNA-221-3p/222-3p inhibition共转染人骨髓间充质干细胞，成功沉默了细胞中的miR-221-3p/222-3p表达水平；miRNA基因芯片与RT-qPCR验证结果显示miR-221-3p/222-3p在软骨分化后期表达明显降低；转染组与未转染组以及空载体组相比：①细胞增殖明显受到抑制。②番红O染色以及免疫组织化学显示软骨分化特征标志物硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原表达增强。③RT-qPCR也证实硫酸软骨素以及Ⅱ型胶原的mRNA表达也明显上调。结果显示沉默人骨髓间充质干细胞miRNA-221-3p/222-3p，抑制了细胞增殖并促进了成软骨分化。 -
Peroxiredoxin 2基因慢病毒载体的构建及对结直肠癌SW480细胞增殖的影响
目的：构建Peroxiredoxin 2（Prdx2）基因慢病毒表达载体，建立能够稳定高表达Prdx2的结直肠癌SW480细胞株，研究Prdx2的高表达对SW480细胞生长增殖的影响。方法：利用PCR扩增Prdx2编码区片段，克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin （GV218）中，构建Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin（LV-Prdx2）慢病毒表达载体，包装产生慢病毒颗粒，鉴定后将其转染SW480细胞，荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达；应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（ qRT-PCR ）和Western blot方法检测SW480细胞中Prdx2的mRNA和蛋白水平表达情况；MTT法检测细胞生长情况；平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果：构建的重组慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin（LV-Prdx2）经鉴定正确；慢病毒转染SW480细胞后，细胞中Prdx2在mRNA和蛋白水平高表达。 MTT法及平板克隆形成实验结果显示Prdx2高表达的SW480细胞增殖能力显著增强（P＜0.05）。结论：成功构建Prdx2基因慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin，筛选出稳定高表达Prdx2的SW480细胞株；高表达的Prdx2分子可显著促进结直肠癌SW480细胞增殖。
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生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建
目的:设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列,并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒.方法:以小鼠SSTR5基因为靶序列,用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA,退火形成双链DNA后,与经BamH I和EcoR I双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR-Pμro/GFP连接,产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒.将重组质粒转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:构建的重组表达质粒PCR产物为161bp,其中插入的SSTR5-siRNA片段为61bp,测序结果与参考序列完全一致.结论:成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒,为进一步采用RNAi技术研究小鼠SSTR5基因表达对其生长情况的影响奠定了基础.
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MIR-122慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系
目的:构建人mir- 122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系.方法:以人has-mir- 122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中.对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR- 122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR- 122的变化.通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR- 122在HepG2细胞中的表达效果.结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确.qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高.表明mir-122慢病毒表达载体构建成功.流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90％以上.Western blot显示mir- 122明显抑制其靶分子表达.进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达.结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础.
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MIR-122慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系
目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系.方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中.对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR- 122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化.通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,western blot检测mir- 122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR- 122在HepG2细胞中的表达效果.结果:pGCSIL-GFP-miR- 122经双酶切分析及测序,插入序列正确.qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高.表明mir- 122慢病毒表达载体构建成功.流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90％以上.Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达.进一步验证pGCSIL-GFP-miR- 122在细胞中的稳定表达.结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir- 122在人体所起的作用及功能机制打下基础.
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人IGF-I基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选
目的 设计并筛选人IGF-I有效RNA干扰片段,构建IGF-I-siRNA慢病毒表达载体.方法 对人IGF-I基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T 细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果 ①成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSI-1、2、3、4,及无关基因的重组质粒PscNC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功;②Realtime-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达低,重组质粒PscNC转染组细胞内IGF-I mRNA的表达量与空白对照的水平接近(P>0.05).结论 成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.在人IGF-I序列位点1010～1028 bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.
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miR-126慢病毒表达载体构建及其对脐静脉内皮细胞增殖的影响
目的:构建miR-126的慢病毒表达载体,包装生产重组慢病毒,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),研究高表达miR-126对HUVEC增殖的影响.方法:从293TN细胞中提取人基因组DNA为模板,PCR扩增miR-126前体序列并克隆至表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP),构建miR-126的慢病毒表达载体.使用脂质体转染的方法将miR-126慢病毒表达载体以及慢病毒包装质粒混合物(LPPM)共转染293TN细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度.使用重组慢病毒Lv-miR-126和对照病毒(Lv-Control)感染HUVEC 72 h后通过Real Time-PCR和免疫印迹检测细胞内miR-126与血管内皮生长因子(VEGF-A)相对含量;MTT检测HUVEC增殖活性的变化.结果:成功调取miR-126前体序列并克隆至表达载体.成功进行了Lv-miR-126重组病毒的生产和滴度测定.Lv-miR-126感染HUVEC后,能够明显增强细胞内miR-126的相对含量,VEGF-A的表达水平则显著降低,蛋白含量下降约60％;同时明显抑制HUVEC的增殖活性,基因干预后48、72 h,细胞增殖活性均明显低于相同时间点对照病毒感染组,差异有统计学意义.结论:在HUVEC中过表达miR-126,可抑制VEGF-A表达,并且抑制内皮细胞增殖.
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PTEN及其突变体可诱导慢病毒表达系统的构建
目的:构建可诱导表达野生型或突变型第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的慢病毒表达体系,为进一步研究PTEN与肿瘤间的关系提供理想的实验工具.方法:提取甲状腺癌、肺癌及其癌旁组织的RNA,经反转录后扩增PTEN片段,将其连接入慢病毒载体,与病毒包装质粒共转染人胚肾T细胞(293T)细胞,获得病毒.将其感染MDA-MB-231细胞,用嘌呤霉素筛选,获得稳定表达的细胞株.采用蛋白印迹法检测稳定转染的细胞株中PTEN基因的表达情况,用软琼脂克隆形成实验检测细胞株的克隆形成能力.结果:在甲状腺癌和肺癌中发现PTEN突变体；蛋白印迹检测结果证实野生型和突变型PTEN的慢病毒表达体系构建成功.突变型PTEN的克隆形成能力强于野生型PTEN.结论:发现了PTEN突变体,并成功构建了野生型和突变型PTEN基因的可诱导慢病毒表达体系,突变型PTEN不但有抑癌作用.还有致癌作用.
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RNAi沉默STAT3对结直肠癌SW480细胞的抑制作用及其机制
目的:慢病毒介导siRNA沉默结直肠癌SW480细胞内信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activators of transcription 3,STAT3)的表达,观察其对SW480细胞凋亡、侵袭、集落形成及下游信号分子Mcl-1、caspase3表达的影响.方法:用携带针对STAT3的siRNA的慢病毒Lenti-STAT3-siRNA感染SW480细胞,Real-time PCR和Western blotting分别检测Lenti-STAT3-siRNA感染对SW480细胞内STAT3、Mcl-1及caspase3 mRNA和蛋白表达的影响,流式细胞术检测下调STAT3表达对SW480细胞凋亡的影响.Transwell实验检测下调STAT3表达对SW480细胞侵袭能力的影响.结果:Lenti-STAT3-siRNA组SW480细胞STAT3 mRNA和蛋白的相对表达量较Lenti-GFP组和对照组显著降低(均P＜0.05).Lenti-STAT3-siRNA组SW480细胞集落形成能力受到抑制,对照组、Lenti-GFP组和Lenti-STAT3-siRNA组SW480细胞凋亡率分别为1.32％、4.92％及11.9％,Lenti-STAT3-siRNA组SW480细胞穿膜细胞数较对照组和Lenti-GFP组显著下降[(178.49±15.42) vs (340.20 ±41.31)、(320.61±13.30)个,均P＜0.05].Lenti-STAT3-siRNA组Mcl-1 mRNA和蛋白的相对表达量显著降低(均P＜0.05),caspase3 mRNA和蛋白的相对表达量显著增加(均P＜0.05).结论:慢病毒Lenti-STAT3-siRNA感染能够有效下调结直肠癌细胞SW480内STAT3基因的表达,促进其凋亡并抑制其侵袭、集落形成能力,其机制可能与降低Mcl-1、提高caspase3的表达有关.
