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虹膜色素上皮细胞自体移植研究进展
虹膜色素上皮细胞(IPE)自体移植术是继视网膜色素上皮细胞(RPE)移植术之后发展起来的一项新技术.它不但避免了异体RPE移植的免疫排斥反应,还克服了自体RPE移植取材操作的困难,为老年性黄斑变性等与视网膜色素上皮损害相关眼病的治愈带来了新的希望.本文介绍IPE的体外培养研究、IPE自体移植的动物实验、临床初步研究及新进展.
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自体色素上皮细胞移植
随着视网膜色素上皮(RPE)细胞移植研究的不断深入,人们对于它可用于治疗老年性黄斑变性(ARMD)等视网膜色素上皮变性类疾病寄予了希望.但异种或同种异体的RPE细胞移植总不能完全避免免疫排斥反应,所以人们开始研究自体色素上皮细胞的移植.本文对近年来有关自体色素上皮细胞(包括虹膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞)的形态、功能、取材及移植等方面的研究作一综述.
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眼色素上皮细胞生理功能的研究现状及进展
视网膜色素上皮细胞移植治疗相关视网膜疾病的研究正广泛展开,由于视网膜色素上皮细胞的同种异体移植产生排斥反应,虹膜色素上皮细胞代替视网膜色素上皮细胞移植成为新的研究领域.本文就近年来视网膜色素上皮细胞和虹膜色素上皮细胞形态学和生理功能上的异同进行综述,并简述视网膜色素上皮细胞的退行性改变.
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虹膜周边切除手术标本的色素上皮细胞体外培养与超微结构研究
目的:体外培养虹膜周边切除标本中的色素上皮细胞(iris pigment epithelium,IPE),并进行生物学检测.方法:用酶-显微解剖-酶分离法培养IPE细胞并传代,免疫组化方法鉴定,透射电镜观察超微结构.结果:酶-显微解剖-酶分离法在小标本可成功获得较高纯度和密度的IPE细胞.其形态与免疫标志物表达与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞相似.结论:培养的IPE细胞为自体移植提供了较可靠的细胞来源.
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体外分离培养猪虹膜色素上皮细胞的生物学评价
目的:培养猪的虹膜色素上皮(IPE)细胞并进行IPE的生物学评价,为IPE移植治疗视网膜色素变性(RP)打下基础.方法:采用酶辅助的显微分离法对50只猪眼进行IPE的原代和传代培养,免疫组化方法鉴定细胞,并对其生物学性状进行评价.结果:从IPE生长曲线上看,细胞于接种后2天开始进入细胞对数生长期,经过3～4天的对数期生长后进入生长缓慢的平台期.细胞培养成功率为85.0%.原代细胞的贴壁率为31.8%±3.7%,细胞的活力为82.5%±5.1%,传代细胞的贴壁率为86.4%±4.3%,细胞的活力为91.2%±3.7%.伸展率为83.6%±5.3%,分裂时间为2～7天,平均3.5±0.96天,总分裂次数为6～10代.免疫组织化学显示,培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白(AE1/AE3)和S-100抗原染色均为阳性.结论:对IPE细胞的生物学评价,不仅证实了IPE细胞高效纯化培养的实现,而且系列完整的数据为IPE移植治疗RP的相关实验提供了必要的基础保证.
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细胞移植在眼科临床的应用
细胞移植是组织修复的一种重要手段.目前己在眼科临床应用的有视网膜色素上皮细胞移植、虹膜色素上皮细胞移植、角膜缘干细胞移植、结膜上皮细胞移植和视网膜感光细胞移植等.本文复习了各种眼科细胞移植的现况及展望.对一些细胞移植的适应证、远期效果及潜在副作用均有待进一步研究.细胞移植与干细胞工程、基因工程及组织工程结合具有一定的发展前景.
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枸杞对虹膜色素上皮细胞增殖活性干预作用的研究
目的寻找能够促进虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium,IPE)增殖活性的相关因素.方法以激光共聚焦显微镜为研究手段,分析枸杞水煎液作用下,IPE线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的变化.通过MTr检测方法了解枸杞对IPE增殖的影响.结果枸杞水煎液在3.125mg/ml到50mg/ml范围内对IPE具有明显的促增殖作用,与剂量呈现相关性.枸杞使IPE细胞线粒体膜电位明显上升,浓度达到22mg/ml时细胞线粒体膜电位明显升高,后逐渐稳定.浓度达到54mg/ml时曲线再次上升.结论枸杞水煎液具有较好的IPE活性保护作用,对体外培养的IPE具有良好的促增殖作用.
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眼科细胞培养的特殊技术
目前已建立了完整的人类眼部组织细胞分离培养技术,生长良好的有视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium,RPE)、虹膜色素上皮细胞、睫状体色素上皮细胞、葡萄膜黑素细胞、各部位成纤维细胞(巩膜、眼球筋膜及角膜)、血管内皮细胞、小梁细胞和部分肌细胞等.
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活体染料标记原代IPEC眼内移植的研究
目的 探讨应用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)标记原代的兔自体虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial cell,IPEC),并移植于视网膜神经上皮层下的可行性.方法 取原代兔眼自体虹膜色素上皮细胞消化分离,经CFDA-SE染色后移植到视网膜神经上皮层下.术后不同时间应用彩色眼底照相、激光扫描检眼镜(SLO)、光学相干断层扫描(OCT)进行活体观察,不同时间点对移植眼进行切片并常规染色及免疫组化,用光学显微镜对移植细胞进行观察和评价.结果 自体移植术后观察显示移植区界限清晰;SLO可观察到移植区内荧光分布;OCT和HE染色均显示移植区神经上皮层下有移植物堆积,并随时间推移逐渐变平.免疫组化显示移植区ZO-1、Actin呈棕色点,有规律地间断分布在Bruch膜上,IPEC嵌插在原始的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,RPEC)间,且形成完整的单层.结论 CFDA-SE作为活体染料标记自体IPEC进行移植时,是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料,可作为理想的标记物应用.
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TCP液在兔眼虹膜色素上皮细胞培养中的应用
目的 寻求一种更好的培养兔眼虹膜色素上皮细胞的方法.方法 采用TCP液和胰酶消化与培养IPE细胞,对比消化后的细胞形态及贴壁率.结果 TCP液消化获取IPE细胞分散均匀,细胞呈圆形,胞质内充满棕黑色颗粒,几乎见不到细胞核,贴壁率为83.6%±2.3%.胰酶消化细胞多呈现絮状、团块及集落样,单个细胞散在,数量较低细胞贴壁率为67.7%±3.5%.结论 TCP液对于消化获取IPE细胞较胰酶有更好的效果.
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家兔虹膜色素上皮细胞移植的实验研究
目的 比较直接分离和体外培养的继二代有色素家兔虹膜色素上皮(IPE)细胞移植于无色素家兔视网膜下间隙后的存活状况.方法 分别选用经酶-显微解剖-酶分离法直接分离的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,和经过体外培养至继二代的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,制成相同密度的IPE细胞悬液.采用术中检眼镜定位的外路移植法将其植入无色素家兔视网膜下间隙.术后每日直接检眼镜观察眼底,并分别于术后的第1、2、4、8、12、16周对兔眼移植区作光镜检查.结果 两种不同方式制备的有色素家兔虹膜色素上皮细胞均可在无色素家兔视网膜下间隙存活.其中,经体外培养的虹膜色素上皮细胞移植后呈较均匀的单层排列.植入的虹膜色素上皮细胞在观察期内均未见明显炎症和排斥反应.结论 检眼镜定位的外路法可以将供体家兔IPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙,经体外培养的继二代家兔虹膜色素上皮细胞存活形态好于直接分离的家兔虹膜色素上皮细胞.
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体外培养的成人虹膜与视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子的表达
目的:比较血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) mRNA在体外培养的成人虹膜色素上皮(iris pigment epithelium,IPE)细胞与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达情况,探讨IPE细胞移植替代RPE细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,ARMD)的可行性.方法:取生长近融合的传代2次的IPE及RPE细胞,Trizol一步法提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测VEGF mRNA的表达水平.结果:体外培养的IPE与RPE细胞均可表达VEGF mRNA,IPE细胞的VEGF mRNA表达量较RPE细胞低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:以自体IPE细胞替代RPE细胞进行移植,可能对于ARMD等新生血管增殖性疾病的治疗是有益的.
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牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较
目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.
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腺相关病毒介导色素上皮衍生因子转染人虹膜色素上皮细胞的体外研究
目的 探讨以腺相关病毒(AAV)为载体,对体外培养的人虹膜色素上皮(IPE)细胞进行色素上皮衍生因子(PEDF)转染,获得高效表达PEDF转基因细胞的可行性.方法 构建携带PEDF基因的重组AAV载体AAV-PEDF,体外培养人IPE,用1 × 106 pfu的AAV-PEDF按感染复数(MOI)为0、2、10和20分别感染体外培养的IPE细胞；荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况；流式细胞术检测细胞转染效率；RT-PCR和Western blotting法鉴定PEDF在IPE细胞中的表达.结果 AAV-PEDF转染后,IPE细胞生长正常,用荧光显微镜、RT-PCR和Western blotting均检测到PEDF表达.在MOI为20时,细胞感染阳性率达64.22％.结论 AAV-PEDF能有效地转染体外培养的IPE细胞并有效表达PEDF.
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人胚虹膜色素上皮细胞的初步培养和鉴定
目的:建立人胚虹膜色素上皮细胞(IPE)分离、纯化培养体系并进行鉴定,为进一步研究IPE提供实验基础.方法:取胎龄为15周左右新鲜水囊引产的人胚眼球,取下虹膜组织,用胰蛋白酶消化,将虹膜色素上皮细胞置于培养瓶中,2周后传代,倒置相差显微镜观察,并取对数生长期细胞分别用透射电镜和扫描电镜检查,用单克隆鼠抗角蛋白抗体(AE1/AE3)标记培养细胞进行鉴定.结果:用胰酶分离消化法,人胚虹膜色素上皮细胞易分离和贴壁.细胞形态与视网膜色素上皮细胞形态极为相似,表现为多边形和梭形两种形态,胞质内含色素颗粒,传代细胞内的色素颗粒比原代细胞的色素颗粒少.免疫细胞化学染色阳性,胞质内见棕黄色染色.结论:人胚虹膜色素上皮细胞分离、纯化的实现为IPE细胞生理功能和IPE移植的深入研究提供了可能.
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杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞
目的:研究重组杆状病毒(baculovirus)载体介导β-半乳糖苷酶基因(LacZ)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况.方法:将质粒pCMV-β中的CMV-LacZ表达盒插入杆状病毒表达载体pFast BacI的Eco RI/Hind Ⅲ位点,构建重组质粒pBac-β,并利用Bac-to-Bac表达系统在Sf9细胞中产生出重组杆状病毒BV-β.将MOI为200的BV-β感染经酶消化加显微法分离培养的IPE细胞,24 h后进行X-gal染色.在显微镜下观察IPE中LacZ表达阳性的情况,记录阳性细胞所占的百分比.结果:限制性酶切分析及测序结果表明,我们已成功构建表达质粒pBac-β及重组杆状病毒BV-β.X-gal染色证实杆状病毒介导LacZ在细胞中的表达呈蓝色,弥漫于整个胞浆.感染后24 h时表达阳性率达85%.结论:重组杆状病毒可有效介导报告基因在体外培养的IPE细胞中表达,为利用杆状病毒构建可供移植的基因工程化虹膜色素上皮细胞提供了实验依据.
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人眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定
目的:观察体外培养的人眼虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium,IPE)的生长状况,用透射电镜、细胞免疫化学实验鉴定其性质,为进一步研究IPE细胞生理、病理作用提供模型.方法:对来源于不同个体的健康人眼采用酶消化加显微分离法,分离IPE细胞,对其进行培养、传代、冻存和复苏.用透射电镜、细胞免疫化学法鉴定细胞性质.建立IPE细胞的有限细胞系.结果:原代培养的IPE呈棕黑色多角形或不规则形,24 h内73%细胞贴壁.贴壁细胞体积变大呈多边形或方形,胞核轮廓变清,胞浆内充满黑色素颗粒.分裂增殖生长的细胞色素颗粒逐渐减少,4～6代后细胞内色素随着不断分裂逐渐减少至消失,部分形态变为成纤维细胞状.电镜下可见细胞表面有丰富的微绒毛,胞浆内含少量色素颗粒.细胞免疫化学抗角蛋白与抗S-100染色显示IPE细胞胞质呈鲜红色着色.结论:采用酶消化加显微分离法可以建立人IPE的有限细胞系.
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腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染及毒性
目的研究腺相关病毒(recombinant adeno-associatd virus,rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)对体外培养虹膜色素上皮细胞(irispigment epithelial,IPE)的转染和病毒载体对IPE细胞的毒性,为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据.方法酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定.按转染倍数(multiple of infection,MOI)为103、104、105、106转染已培养3d的传二代IPE细胞,流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率.MTT法检测rAAV-GFP对IPE细胞的毒性.结果rAAV-GFP对IPE的转染效率,MOI=103时为26.7%、MOI=104时为53.6%、MOI=105时为60.2%、MOI=106时是63.7%.AAV-GFP转染IPE细胞后,细胞生长正常,MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异.结论rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上,而且腺相关病毒对细胞生长无明显抑制,腺相关病毒作为视网膜色素变性基因治疗的载体是安全可行的.
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腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达
目的研究重组腺相关病毒(rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因(GFP)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达,为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据.方法酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定.按转染倍数(MOI)为103、104、105、106转染已培养3 d的传二代IPE细胞,转染后的第1、3、5、7、9 d,在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况,记录100个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比.当GFP表达稳定后,共聚焦显微镜照相,流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率.结果rAAV-GFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆.MOI=103时,转染后48 h,GFP开始表达,MOI=104、105、106时,转染后24 h时便可看到GFP表达阳性的细胞,细胞的起始表达强度不一,随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7～9 d达到高峰并维持,此时检测rAAV-GFP对IPE的转染效率,MOI=103时是26.7%,MOI=104时是53.6%,MOI=105时是60.2%,MOI=106时是63.7%.结论rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上,将腺相关病毒载体介导的基因治疗和IPE移植结合起来治疗视网膜色素变性是可行的.
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兔眼虹膜和视网膜色素上皮细胞移植的形态学观察
目的比较有色兔虹膜色素上皮及视网膜色素上皮细胞在白兔视网膜下腔的生长状况.方法分离培养有色兔的IPE及RPE细胞.采用内路法在8只白兔16眼中进行了IPE和RPE细胞悬液的移植,其中左眼移植IPE细胞,右眼移植来自同一供体兔的RPE细胞.8只兔分别在2周(n＝3)、4周(n＝3)和6周(n＝2)时处死.对眼球壁做光镜和电镜检查.结果IPE和RPE细胞在异体视网膜下腔存活,绝大多数贴附在Bruch's膜上,并具有极性,细胞基底部有大量的皱褶,细胞顶部有一些微绒毛.6周时未见移植细胞周围有炎性细胞浸润.结论移植的IPE和RPE细胞可以在视网膜下腔存活,它们的形态均和原先RPE细胞类似.IPE细胞有望替代RPE细胞用于移植.
